基本信息?
產(chǎn)品名稱 | pUC57simpleEVL Seamless 試劑盒 | 貨號(hào) | P-PR1223 |
規(guī)格 | 20 次 | 用途 | 僅供科研 |
?英文名稱?：pUC57simpleEVL Seamless Cloning Kit
作用機(jī)制：利用無(wú)縫克隆技術(shù)，通過(guò)同源重組將目標(biāo)基因片段插入到pUC57simple載體中，實(shí)現(xiàn)無(wú)縫連接，無(wú)需限制性內(nèi)切酶和連接酶，操作簡(jiǎn)便，克隆效率高。
適用樣本：適用于分子克隆實(shí)驗(yàn)，用于構(gòu)建重組質(zhì)粒、基因測(cè)序載體等，樣本為PCR擴(kuò)增的目標(biāo)基因片段。
產(chǎn)品概述
pUC57simpleEVL Seamless試劑盒是一款以pUC57simple為載體的無(wú)縫克隆試劑盒，專為快速、無(wú)縫構(gòu)建重組DNA分子設(shè)計(jì)。pUC57simple是一種常用的克隆載體，具有復(fù)制起點(diǎn)、氨芐青霉素抗性基因、多克隆位點(diǎn)等元件，便于質(zhì)粒的擴(kuò)增與篩選。該試劑盒基于同源重組技術(shù)，利用重組酶催化目的DNA片段與pUC57simple載體末端的同源序列發(fā)生重組，實(shí)現(xiàn)無(wú)縫連接，無(wú)需限制性內(nèi)切酶酶切與T4 DNA連接酶連接。它適用于單片段或多片段的克隆，可快速將目的基因插入到載體中，且連接產(chǎn)物無(wú)冗余的酶切位點(diǎn)序列，避免了對(duì)目的基因表達(dá)或功能的影響。試劑盒操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)條件溫和，克隆效率高，廣泛應(yīng)用于基因克隆、載體構(gòu)建、蛋白表達(dá)載體制備等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
產(chǎn)品特點(diǎn)
經(jīng)典載體骨架：基于pUC57載體改造，高拷貝復(fù)制，質(zhì)粒提取產(chǎn)量高，穩(wěn)定性好。
無(wú)縫克隆技術(shù)：通過(guò)同源重組連接目的片段與載體，無(wú)冗余序列殘留，不影響基因表達(dá)。
廣譜兼容性：適用于單片段克隆與多片段拼接，插入片段長(zhǎng)度可達(dá)8kb以上。
篩選標(biāo)記完善：包含氨芐青霉素抗性基因與藍(lán)白斑篩選標(biāo)記，便于陽(yáng)性克隆篩選。
核心PCR試劑及使用方法
1. Taq DNA聚合酶
作用：催化DNA鏈的延伸，是PCR反應(yīng)的核心酶
使用方法：
通常按0.5-2U/25μL體系添加，具體用量參照試劑說(shuō)明書(shū)
酶對(duì)溫度敏感，需在冰上操作，避免反復(fù)凍融
最后加入酶液，防止提前激活導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增
2. dNTP混合液
作用：提供DNA合成的原料（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）
使用方法：
終濃度一般為200μmol/L每種dNTP，總濃度800μmol/L
避免反復(fù)凍融，可分裝成小體積儲(chǔ)存
注意pH值，過(guò)酸或過(guò)堿會(huì)抑制聚合酶活性
3. PCR緩沖液
作用：提供酶促反應(yīng)的適宜環(huán)境（pH、離子濃度）
使用方法：
通常為10×濃度，使用時(shí)稀釋至1×終濃度
含Mg2+的緩沖液需注意Mg2+濃度，一般1.5-2.5mmol/L為最優(yōu)范圍
部分緩沖液含KCl、Tris-HCl等成分，無(wú)需額外添加
4. 引物（上游/下游）
作用：定位擴(kuò)增區(qū)域，引導(dǎo)DNA合成起始
使用方法：
終濃度一般為0.1-1μmol/L，根據(jù)引物Tm值調(diào)整
引物需用TE緩沖液或無(wú)菌水溶解，濃度計(jì)算準(zhǔn)確
避免引物降解，-20℃分裝儲(chǔ)存，避免反復(fù)凍融
5. 模板DNA
作用：提供擴(kuò)增的原始DNA模板
使用方法：
模板濃度一般為1ng-1μg/25μL體系，根據(jù)模板類型調(diào)整
基因組DNA需充分純化，避免蛋白、RNA等雜質(zhì)污染
質(zhì)粒DNA可適當(dāng)減少用量，一般10-100ng即可
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實(shí)驗(yàn)流程
反應(yīng)體系配制：按1×工作濃度混合預(yù)混液、模板（10-100 ng）、引物（0.2-0.5 μM）及無(wú)核酸酶水。
PCR程序：
預(yù)變性：95℃ 30 sec
擴(kuò)增循環(huán)（40×）：95℃ 5 sec → 60℃ 30 sec（熒光采集）
熔解曲線分析：60-95℃梯度升溫。
注意事項(xiàng)
避免反復(fù)凍融，推薦分裝保存。
熔解曲線需呈現(xiàn)單一峰以確保擴(kuò)增特異性。
若需絕對(duì)定量，建議配套標(biāo)準(zhǔn)品使用。
關(guān)鍵字： 蛋白酶及磷酸酶抑制劑混合物ABC（100;Protease and Phospha;
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