本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA檢測(cè)原理，酶標(biāo)板微孔固相固定有抗小鼠丙酮酸脫氫酶E1（PDH E1）特異性抗體。檢測(cè)過(guò)程中，樣本與標(biāo)準(zhǔn)品中的PDH E1抗原與固相抗體特異性結(jié)合，洗去未結(jié)合的游離成分后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的配對(duì)檢測(cè)抗體，構(gòu)建固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體免疫復(fù)合物。充分洗滌后加入TMB底物顯色，酶促反應(yīng)的顯色深淺與樣本中PDH E1含量成正比，終止反應(yīng)后測(cè)定吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可精準(zhǔn)計(jì)算樣本中目標(biāo)蛋白的含量。
基本參數(shù)?：
產(chǎn)品名稱：小鼠丙酮酸脫氫酶E1(PDH E1) ELISA試劑盒
英文名稱：PDH E1 ELISA Kit
貨號(hào)：Y-E2202
規(guī)格：48T/96T
靈敏度：檢出下限 0.10ng/mL
檢測(cè)范圍：0.22ng/mL～38ng/mL
反應(yīng)時(shí)間：樣本 37℃孵育 78min，酶標(biāo)記物 46min，顯色 16min，終止后立即測(cè)值，總時(shí)長(zhǎng) 140min
保存條件：試劑盒 2～8℃儲(chǔ)存，嚴(yán)禁冷凍；酶結(jié)合物凍融一次即報(bào)廢
顯色系統(tǒng)：雙液混合 TMB 顯色
檢測(cè)波長(zhǎng)：450nm 單波長(zhǎng)
標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：六組標(biāo)準(zhǔn)濃度，線性擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，剔除偏離值后計(jì)算
注意事項(xiàng)：線粒體提取樣本避免氧化降解；操作全程盡量避光。
通用注意事項(xiàng)：
樣本要求
血清、血漿避免嚴(yán)重溶血、脂血、黃疸；組織勻漿充分離心去除沉淀；樣本分裝凍存，反復(fù)凍融≥3 次會(huì)導(dǎo)致抗原降解，檢測(cè)值偏低。
溫度控制
孵育溫度嚴(yán)格 37℃，溫箱溫度波動(dòng)、室溫過(guò)低會(huì)降低結(jié)合效率，背景升高、重復(fù)性變差。
避光操作
TMB 底物、酶結(jié)合物、神經(jīng)遞質(zhì) / 維生素類靶標(biāo)樣本見(jiàn)光易氧化，顯色全程避光，試劑避光存放。
洗板規(guī)范
洗滌不充分會(huì)造成高背景、假陽(yáng)性；拍干時(shí)使用干凈吸水紙，禁止交叉污染微孔。
污染防控
實(shí)驗(yàn)耗材無(wú) DNase、RNase、蛋白酶；槍頭一次性更換，標(biāo)準(zhǔn)品與樣本避免交叉加樣；底物液變色、出現(xiàn)沉淀不可使用。
安全防護(hù)
終止液含稀硫酸，具有腐蝕性，避免接觸皮膚、黏膜；實(shí)驗(yàn)廢液集中收集中和后處理，不可直接傾倒。
失效判定
試劑盒超出有效期、試劑渾濁變色、標(biāo)準(zhǔn)品梯度無(wú)明顯顏色差異，均判定失效，禁止繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。
稀釋校正
樣本 OD 值高于最高標(biāo)準(zhǔn)孔時(shí)，必須稀釋重測(cè)，最終結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)；低于最低檢測(cè)限標(biāo)注 “低于試劑盒靈敏度”。
空白對(duì)照
空白孔吸光度應(yīng)極低，若空白孔 OD＞0.1，說(shuō)明洗滌不充分或試劑污染，實(shí)驗(yàn)作廢重做。
儲(chǔ)存禁忌
試劑盒不可冷凍結(jié)冰，冷凍會(huì)造成酶標(biāo)抗體蛋白變性，直接導(dǎo)致試劑盒完全失效。
實(shí)驗(yàn)步驟如下：
試劑盒室溫放置 33min 回溫，稀釋洗滌液，配制 PDH E1 梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液。
酶標(biāo)板添加標(biāo)準(zhǔn)品、小鼠細(xì)胞裂解樣本、空白對(duì)照液，規(guī)范加樣。
一步加入酶結(jié)合工作液，密封封板，37℃避光孵育 72min。
棄液洗板 5 次，每次浸泡 30s，吸水紙拍干微孔。
顯色混合液遮光顯色 18min。
滴加終止液終止反應(yīng)，混勻板面。
雙波長(zhǎng)測(cè)值，定量樣本 PDH E1 表達(dá)量。
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