背景及概述^[1]

加壓素（vasopressin，AVP）又稱后葉加壓素、抗利尿激素，是由下丘腦的視上核神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生的環(huán)狀肽類激素。加壓素在臨床上主要用于尿崩癥、食管靜脈曲張出血的治療，也用于中樞性尿崩癥、腎性尿崩癥和精神性煩渴的鑒別診斷。賴氨酸加壓素?zé)o色透明溶液pH3.7～4.3，內(nèi)含緩沖劑醋酸鈉、抗菌劑三氯甲基叔丁醇及氯化鈉。具有天然加壓素的各種生物活性，每單位賴加壓素的抗利尿作用相當(dāng)于人"精加壓素"的一半，其血管收縮特性僅在施用高藥量時才顯現(xiàn)出來。作用時間比尿崩停短，只有4小時左右。

標(biāo)準(zhǔn)^[1]

賴氨酸加壓素，哺乳動物如豬等腦下垂體后葉分泌激素，與加壓素結(jié)構(gòu)唯一不同點在于第八位由精氨酸換成賴氨酸。USP38收載其鼻腔腔溶液。主峰與精氨酸加壓素的分離度不得小于1.1。

作用與用途^[2]

本品為合成加壓素，其作用同垂體后葉吸入劑。

維持時間約4小時，對鼻黏膜刺激較少，對嚴(yán)重的尿崩癥病人療效不明顯。

賴氨酸加壓素用于輕、中型尿崩癥的治療。

用量與用法^[2]

賴氨酸加壓素為噴霧劑：每次向鼻腔內(nèi)噴1～2下，每日3～5次。

不良反應(yīng)與注意事項^[2]

賴氨酸加壓素作用時間短，對嚴(yán)重病人療效較差。

劑型^[2]

噴霧劑：5mL(每毫升含50加壓單位)。

制備^[3]

微波促進(jìn)合成載有還原型催產(chǎn)素及血管加壓素：

1）樹脂的溶脹：取Fmoc-RinkAmide-MBHAresin(取代量為0.5mmol/g)，將兩批各1.2g(0.6mmol)Fmoc-RinkAmide-MBHAresin經(jīng)25mLDCM溶脹30min，抽去DCM，再用25mLNMP溶脹30min，最后分別用NMP，DCM，NMP10mL沖洗干凈.微波促進(jìn)脫除Fmoc保護(hù)基：將上述溶脹好的樹脂放入反應(yīng)器中，加入10mL含0.1mol•L－1HOBT的25%哌啶/NMP(V/V)溶液，在微波反應(yīng)器中反應(yīng)1min，微波功率為15W，反應(yīng)溫度控制在45℃以內(nèi)，使用空氣壓縮機(jī)壓縮空氣冷卻，反應(yīng)結(jié)束后濾去溶液；再加入10mL含0.1mol•L－1HOBT的25%哌啶/NMP(V/V)溶液在微波反應(yīng)器中再反應(yīng)4min，微波功率為25W，反應(yīng)溫度控制在45℃以內(nèi)，使用空氣壓縮機(jī)壓縮空氣冷卻.反應(yīng)結(jié)束后濾去溶液，用NMP洗滌干凈.得到脫去初始連接的Fmoc保護(hù)基的樹脂.微波促進(jìn)Fmoc-Gly-RinkAmide-MBHAresin的合成：將Fmoc-Gly-OH(3.0mmol)，HBTU(3.0mmol)，HOBT(3.0mmol)和DIPEA(6.0mmol)溶于15mLNMP中，再將此溶液加入上面的樹脂中，在微波反應(yīng)器中反應(yīng)5min，微波功率為25W，反應(yīng)溫度控制在45℃以內(nèi)，使用空氣壓縮機(jī)壓縮空氣冷卻.反應(yīng)結(jié)束后濾掉反應(yīng)液，用DCM和NMP各10mL洗滌樹脂3次.偶合效率的定性檢測：用文獻(xiàn)[16]報道的茚三酮法定性檢測樹脂的偶合效率，顯色反應(yīng)為陰性即可進(jìn)入下一個偶合循環(huán).脯氨酸(Pro)的檢測用文獻(xiàn)報道的溴酚蘭法.肽鏈的延長：按照催產(chǎn)素和賴氨酸加壓素各自的序列，重復(fù)上述脫保護(hù)和偶合的步驟依次連接上相應(yīng)的氨基酸，偶合微波促進(jìn)反應(yīng)時間5～20min不等.接完最后一個氨基酸后Fmoc保護(hù)基暫時不用脫除，各自得到連有還原型催產(chǎn)素和還原型賴氨酸加壓素兩種不同多肽的樹脂.

2）微波輔助I2氧化法固相形成二硫鍵

將上述得到的兩種不同的N端Fmoc未脫除的還原型樹脂各0.2mmol放入反應(yīng)器中，加入10mL溶有0.15gI2的苯甲醚/NMP(V/V＝1/50)溶液中，在微波反應(yīng)器中反應(yīng)10min，微波功率為10W，反應(yīng)溫度控制在45℃以內(nèi)，使用空氣壓縮機(jī)壓縮空氣，氣流冷卻.反應(yīng)結(jié)束后濾除反應(yīng)液，分別用四氯化碳，DMF，DCM將樹脂洗滌干凈，再按照上面脫除Fmoc保護(hù)基的方法脫去N端最后一個殘基連接的Fmoc保護(hù)基.

3）常溫下I2氧化法固相形成二硫鍵

將上述得到的兩種不同的N端Fmoc未脫除還原型樹脂各0.2mmol放入反應(yīng)器中，各加入10mL溶有0.15gI2的苯甲醚/NMP(1∶50，V/V)溶液中，在常溫下反應(yīng)2h.反應(yīng)結(jié)束后濾除反應(yīng)液，分別用四氯化碳，DMF，DCM將樹脂洗滌干凈，再按照上面脫除Fmoc保護(hù)基的方法脫去N端最后一個殘基連接的Fmoc保護(hù)基.

4）樹脂上多肽的裂解

將上述得到的兩種載有不同還原型多肽的樹脂、在微波促進(jìn)條件下和常溫下條件氧化得到兩種載有不同環(huán)肽的樹脂各0.2mmol放入反應(yīng)瓶中，各加入裂解劑RegeantK[V(TFA)∶V(苯甲硫醚)∶V(水)∶V(苯酚)∶V(EDT)＝82.5∶5∶5∶5∶2.5]10mL，先在0℃下振搖30min，再在常溫下反應(yīng)1h.反應(yīng)結(jié)束后抽濾，加少量TFA和DCM洗滌3次，合并濾液.將濾液加入大量的冰乙醚中析出白色絮狀沉淀，冷凍離心得到相應(yīng)的粗品.

5）粗品的純化將最后得到的還原型和氧化型多肽粗品溶于少量的水中，用島津制備型反相HPLC純化粗品.純化中采用C18反相制備柱(340mm×28mm)；流動相A：0.1%TFA/水(V/V)，流動相B：0.1%TFA/乙腈(V/V)；流動相梯度：流動相B20%～65%，40min；流速為5mL•min－1；檢測波長為214nm.收集的溶液凍干得還原型和氧化型多肽的純品.

主要參考資料

[1] 加壓素及其類似物研究進(jìn)展

[2] 最新全科醫(yī)師用藥手冊

[3] 微波促進(jìn)催產(chǎn)素和賴氨加壓素環(huán)肽的固相合成