背景及概述^[1]

原花青素是一類由兒茶素、表兒茶素或沒食子酸聚合而成的多酚類黃酮化合物。廣泛存在于水果、蔬菜、花朵、堅果和樹皮中。在植物體內(nèi)可轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄇ嗨?。流行病學(xué)資料表明花青素有降低腸胃癌癥風險、心血管病風險及預(yù)防女性尿路感染等作用。原花青素又名縮合鞣質(zhì)，在自然界分布廣泛，且常存在于日常食品和許多植物中，如紅酒、松樹皮等。很多食源性的原花青素可以在日常生活中被人們所攝取，并且具有很強的生物活性，如花生種皮中的原花青素可以降血糖，蘋果中的原花青素具有抗癌活性，紅酒中的原花青素可預(yù)防心血管疾病等。這些研究結(jié)果揭示原花青素可作為食源性藥物用于疾病治療。目前，原花青素已被應(yīng)用于藥品、保健品和食品等領(lǐng)域。美國近年批準的僅有的兩個天然藥物均為原花青素類，分別是綠茶的兒茶素組分（商品名Veregen）和秘魯巴豆中純化出的原花青素低聚體Fulyzaq（商品名Crofelemer），國內(nèi)外也開發(fā)出許多原花青素保健品，如康恩貝生產(chǎn)的葡萄籽蘆薈軟膠囊等；在食品領(lǐng)域，原花青素可作為天然的食源性防腐劑，原花青素的生物活性強、自然來源豐富、可通過飲食攝取，對人體健康和疾病防治有重要作用。

結(jié)構(gòu)^[2]

原花青素是以黃烷-3-醇為結(jié)構(gòu)單元通過C—C鍵聚合而形成的化合物，其結(jié)構(gòu)取決于五方面：1）黃烷-3-醇單元的類型；2）單元之間的連接方式；3）聚合程度（組成單元的數(shù)量）；4）空間構(gòu)型；5）羥基是否被取代（如羥基的酯化、甲基化等）。根據(jù)原花青素的聚合程度可分為單倍體（monomer）、寡聚體（oligomer）和多聚體（polymer），其中單倍體是基本結(jié)構(gòu)單元，寡聚體由2～10個單倍體聚合而成，多聚體則由10個以上的單倍體聚合而成。

1. 單倍體

單倍體是構(gòu)成原花青素的結(jié)構(gòu)單元，屬于黃烷-3-醇類化合物，該類成分可通過一定方式連接形成原花青素。單倍體一般是兒茶素（catechin）和表兒茶素（epiactechin），但是也有其他的單倍體，如多一個羥基的表沒食子兒茶素（epigallocatechin）或少一個羥基的表阿夫兒茶精（epiafzelechin）。上述4種單倍體的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖所示。

2. 寡聚體

寡聚體是指由2～10個單倍體通過一定方式連接起來的化合物，該類成分是原花青素研究中最活躍的部分，不斷有新的化合物被報道。寡聚體的分類標準有聚合度、連接方式和單倍體類型：聚合度是指組成原花色素的結(jié)構(gòu)單元個數(shù)，是區(qū)分原花青素的重要標準之一。隨著原花青素聚合程度的增加，分子質(zhì)量也成倍地增加，羥基越多，和填料之間的吸附越大，分離越困難，在圖譜解析中，各個結(jié)構(gòu)單元的峰重疊在一起，結(jié)構(gòu)鑒定難度隨著聚合度增加而加大，因此隨著聚合度的增加（四聚體以上），被報道的原花青素單體從數(shù)量上減少。寡聚體的連接方式有兩種，一種為單倍體通過C2—O—C7的醚鍵和C4—C8或C4—C6兩個鍵連接在一起，稱之為A型（A-typeprocyanidins）；另一種為單倍體通過C4—C8或C4—C6一個鍵連接在一起，稱之為B型（B-typeprocyanidins），在自然界中，多數(shù)植物含有的是B型原花青素，只有少數(shù)植物，如花生、荔枝和肉桂等富含A型二聚體。大多數(shù)寡聚體的結(jié)構(gòu)單元是兒茶素或表兒茶素，但是也有少數(shù)寡聚體是由表沒食子兒茶素或表阿夫兒茶精組成的。本文將寡聚體按照聚合度分類，對每種聚合度包含的不同連接方式和單倍體進行一一介紹。

1）二聚體

二聚體是由兩個單倍體通過一定的方式連接起來的化合物，根據(jù)其連接方式分為兩種，分別是通過C—C鍵和C—O—C連接的A型，如原花青素A1和通過一個C—C鍵連接的B型，如原花青素B。結(jié)構(gòu)單元種類也很多，如結(jié)構(gòu)單元含有表阿夫兒茶精的表阿夫兒茶精-表兒茶素（epiafzelechin-(4β→8)-epicatechin）、含有表沒食子兒茶素的表沒食子兒茶素-(2β→O-7，4β→8)-表兒茶素。

2）三聚體

三聚體是通過一定方式連接的3個單倍體組成的化合物。多數(shù)三聚體，如原花青素C1（procyanidinC1）通過兩個C—C單鍵連接。也有三聚體如肉桂鞣質(zhì)B1（cinnamtanninB1混合有兩個C—C單鍵和一個C—O—C醚鍵連接的單元。還有非常少見的三聚體具有兩組C—C單鍵和醚鍵的連接方式，如七葉樹鞣質(zhì)C。還有比較特殊的三聚體，其結(jié)構(gòu)單元并非全部是兒茶素或表兒茶素，而是其他單倍體構(gòu)成，如表兒茶素-(2β→O-7，4β→8)-表阿夫兒茶精-(4α→8)-表兒茶素。

3）四聚體

四聚體是4個單倍體通過一定連接方式組成的化合物。連接方式有很多種，如只是通過C—C單鍵連接的化合物如肉桂鞣質(zhì)A2（cinnamtanninA2），或者除了C—C單鍵還有1個C—O—C醚鍵的連接如表兒茶素-(2β→O→7，4β→8)-表兒茶素-(4β→8)-兒茶素-(4α→8)-表兒茶素（epicatechin-(2β→O→7，4β→8)-epicatechin-(4β→8)-catechin-(4α→8)-epicatechin），或者結(jié)構(gòu)中有兩個C—O—C醚鍵形成的四聚體，如長節(jié)珠鞣質(zhì)A2（parameritanninA2）。結(jié)構(gòu)單元組成也有多種，如從蕨類植物中分離得到的骨碎補素（davallin）四聚體的構(gòu)成單元含有表阿夫兒茶精。

4）五聚體

5個單倍體通過一定連接方式形成的化合物是五聚體，目前分離得到的單體較少，種類也較少。已分離得到的五聚體大多的是通過C—C單鍵連接，如肉桂鞣質(zhì)A3（cinnamtanninA3）。目前僅有一個化合物是含有C—O—C醚鍵的五聚體：表兒茶素-(4β→8)-表兒茶素-(4β→8)-表兒茶素-(2β→O→7，4β→8)-表兒茶素-(4α→8)-兒茶素。五聚體結(jié)構(gòu)單元具有多樣性如表阿夫兒茶精-(4β-8)-[表沒食子兒茶素-(4β-8)-]3-兒茶素中同時具有表沒食子兒茶素和表阿夫兒茶精。

5）六聚體

六聚體是指6個單倍體通過一定方式連接在一起形成的化合物，也是目前從天然產(chǎn)物中分離得到的聚合度最高的原花青素單體。隨著聚合度的增大，分離難度加大，被報道的六聚體的種類和數(shù)量都較少，其結(jié)構(gòu)單元種類也較少，僅有兒茶素或表兒茶素。如結(jié)構(gòu)中只有C—C單鍵的肉桂鞣質(zhì)A4（cinnamtanninA4），或結(jié)構(gòu)中有1個C—O—C醚鍵的菲律賓楠B（machiphilitanninsB）。

3. 多聚體

多聚體是指聚合度大于10的原花青素，由于分子結(jié)構(gòu)龐大，一般是以混合物的形式存在，該類化合物很難分離得到單體，其化學(xué)結(jié)構(gòu)通常以圖7中的形式表示。多聚體通常以分子質(zhì)量區(qū)間來定義，其鑒定也和單體原花青素不同，通常是檢測其構(gòu)成單元的類型和種類，以及連接方式的類型。

生物活性^[2]

1. 抗氧化活性

原花青素具有極強的抗氧化活性，是一種良好的自由基清除劑和脂質(zhì)過氧化抑制劑，其作用機制是原花青素結(jié)構(gòu)中有多個酚性羥基在體內(nèi)釋放H＋，競爭性地與自由基結(jié)合，從而保護脂質(zhì)不被氧化，阻斷自由基鏈式反應(yīng)，并且反應(yīng)后產(chǎn)生的半醌自由基能通過親核加成反應(yīng)生成具有兒茶酸及焦酚結(jié)構(gòu)的聚合物，仍然具有很強的抗氧化活性，實驗證實原花青素及其代謝產(chǎn)物的自由基清除活性一般強于VC和VE。原花青素的構(gòu)效關(guān)系顯示其抗氧化活性與聚合度、羥基的數(shù)量及位置、連接方式和空間構(gòu)型有關(guān)，活性強度一般隨著聚合度的增加而增加，但是有的四聚體活性低于三聚體；C3位置的甲氧基化和糖基化會降低活性；對于B型二聚體，C4—C8連接方式的活性要大于C4—C6連接方式；表兒茶素的活性大于其同分異構(gòu)體兒茶素。同時，抗氧化活性強度受溶劑影響，在水相中增強，在油相中降低。原花青素可使人血清丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量下降4.80%，超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）活力升高2.31%，谷胱甘肽過氧化物酶（glutathioneperoxidase，GSH-Px）活力升高2.45%，并且能顯著降低CCl4中毒小鼠肝脂質(zhì)過氧化損傷，表明原花青素具有較強的抗氧化活性。

2. 防治心血管疾病

著名的法國悖論指出紅葡萄酒有益健康，能預(yù)防心血管疾病，其中發(fā)揮作用的主要成分就是原花青素。原花青素可以清除自由基、降低膽固醇水平、減少血小板黏附、保護血管內(nèi)皮細胞，從而降低血液的黏度、改善微循環(huán)、減輕氧化應(yīng)激損傷，達到預(yù)防心血管疾病的目的。

1)抗心肌缺血再灌注損傷

心肌缺血再灌注損傷是在血液循環(huán)障礙造成缺血后，又恢復(fù)供血時出現(xiàn)微血管和實質(zhì)器官的損傷，主要是由氧自由基引起的。原花青素強大的自由基清除作用可以減少心肌缺血再灌注損傷。原花青素能明顯降低血漿中MDA含量、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartateaminotransferase，AST）和乳酸脫氫酶（LDH）的活性，提高SOD活性，減少心肌梗死面積。葡萄籽原花青素有助于心臟功能的恢復(fù)，也有利于降低心肌缺血再灌注性心律失常的發(fā)生率，且能顯著增加Na＋/K＋-ATPaseα1亞基的表達。同時，ShaoZouhui等[33]發(fā)現(xiàn)通過激活蛋白激酶Akt和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelialnitricoxidesynthase，eNOS），可以提高一氧化氮（nitricoxide，NO）濃度，減少再灌注后的細胞死亡和恢復(fù)收縮功能，從而起到保護心血管的作用。

2)抗動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化是由于動脈內(nèi)膜膽固醇、類脂肪等黃色粥樣物質(zhì)積聚而導(dǎo)致的病變。原花青素通過清除自由基、調(diào)整脂蛋白代謝紊亂，起到抗動脈粥樣硬化的作用。通過建立動脈粥樣硬化兔子模型，口服給予葡萄籽原花青素后，兔血清低密度脂蛋白（lowdensitylipoprotein，LDL）氧化產(chǎn)物明顯減少，表明葡萄籽原花青素通過降低兔子血漿和動脈壁組織液的自由基，從而抑制LDL氧化，表現(xiàn)出抗動脈粥樣硬化的作用。MDA在動脈粥樣硬化的形成過程中有極重要的作用，通過修飾LDL成為MDA-LDL后，能被單核巨噬細胞辨識、內(nèi)飲，形成泡沫細胞，造成動脈粥樣硬化，采用61名健康人做為研究對象，在12周內(nèi)分別給予葡萄籽原花青素藥片和安慰劑，采用單盲法測定MDA-LDL水平，結(jié)果表明從第6周開始，服用原花青素藥片比服用安慰劑的受試者血漿中MDA-LDL明顯降低，證實葡萄籽原花青素能有效降低LDL氧化，防治動脈粥樣硬化。建立新西蘭大白兔動脈粥樣硬化模型，用1%葡萄籽原花青素顆粒飼料喂食，測定兔血清中各項指標。病理學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)兔血清C反應(yīng)蛋白水平在第1周末期明顯下降，作用可持續(xù)至實驗結(jié)束，并且動脈粥樣硬化病變程度（主動脈壁厚度和泡沫細胞數(shù)量）明顯降低，由此認為原花青素抗動脈粥樣硬化的作用機制與降低血清C反應(yīng)蛋白水平有關(guān)。

3）保護血管內(nèi)皮細胞

內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)和功能的改變是多種心血管疾病的共同病理基礎(chǔ)，其中NO是內(nèi)皮細胞最重要的舒血管因子，能抑制血小板聚集，抑制單核細胞黏附于內(nèi)皮細胞。原花青素可通過增加NO的合成，保護血管內(nèi)皮細胞，進而保護心血管系統(tǒng)。采用兩腎一夾法建立腎血管性高血壓大鼠模型，采用葡萄籽原花青素治療6周后發(fā)現(xiàn)大鼠尾動脈收縮壓顯著降低，其作用機制與增強抗氧化活性，增加NO的產(chǎn)生和釋放，降低血管內(nèi)皮細胞中內(nèi)皮素的蛋白表達有關(guān)。證實葡萄籽原花青素能夠防止過氧亞硝基攻擊血管內(nèi)皮細胞，改善冠狀動脈內(nèi)皮細胞，增加NO的合成，增強人體動脈內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)，從而達到保護心血管系統(tǒng)的目的。

3. 降血壓

高血壓是一種以動脈血壓持續(xù)升高為特征的進行性“心血管綜合征”，常伴有其他臨床病癥，需要患者長期服藥，因此需要尋找有效的、低毒性、適合長期使用的藥物治療高血壓。以高血壓患者和健康人共計119名作為研究對象，進行4個月飲食干預(yù)，高劑量組（每餐給予300mg原花青素）中93%的血壓恢復(fù)正常，由此認為葡萄籽原花青素可以作為非藥物干預(yù)方法治療高血壓。建立家兔離體胸主動脈環(huán)灌流模型，發(fā)現(xiàn)葡萄籽原花青素能減少Ca2+內(nèi)流、促進NO的釋放、舒張主動脈血管、降低血壓，同時葡萄籽原花青素也能降低正常家兔的動脈血壓。其他植物中的原花青素也具有抗高血壓作用，如博森草莓種子原花青素能明顯降低自發(fā)性高血壓大鼠的收縮壓。

4. 降血脂

原花青素能夠降低血液膽固醇、甘油三酯水平，從而起到降血脂作用。如給高膽固醇飲食大鼠喂食蘋果，30d后，大鼠血清總膽固醇、甘油三酯和LDL的含量分別降低21.0%、27.2%和20.4%，蘋果中所含的原花青素類成分（兒茶素、表兒茶素和原花青素B1）是其降脂主要成分。還有葡萄籽、可可、花生種皮等食材中所含有的原花青素均有降脂作用，表明可以考慮將食源性原花青素作為非藥物方法治療高血脂。

5. 降血糖

原花青素的降血糖作用機制如下：1）減少腸道的糖吸收，如花生種皮原花青素能抑制小腸二糖酶活性，從而減少小腸中麥芽糖和蔗糖的吸收，其中3個三聚體（肉桂鞣質(zhì)D-1、表兒茶素-(2β→O→7，4β→8)-[兒茶素-(6→4β)]-表兒茶素、表兒茶素-(4β→8)-表兒茶素-(2β→O→7，4β→8)-兒茶素）的降血糖活性強于二聚體和兒茶素，并且活性和結(jié)構(gòu)單元有關(guān)，如以表兒茶素為單元的低聚物活性大于以兒茶素為單元組成的低聚物；2）作用于胰島β細胞，促進胰島素釋放，如葡萄籽原花青素作用于胰島β細胞，影響胰島素的合成、分泌和基因表達，修復(fù)受損線粒體超極化，減少三磷酸腺苷合成和改變細胞的膜電位，并且減緩葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2抗體葡糖激酶和解偶聯(lián)蛋白基因表達以及改變肝臟降解酶的表達，從而影響胰島素降解。不同連接方式的原花青素可能具有不同的降血糖機制，如在肉桂中A型和B型原花青素均有降血糖作用，但作用機制不同，A型原花青素能提高血液和胰腺中的胰島素濃度，而B型原花青素提高脂肪組織和肝臟的脂質(zhì)積累。

6. 抗腫瘤

原花青素的抗腫瘤作用機制是通過抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)信號分子（如Bcl-2、c-Fos、c-Jun、Ki67等）的表達、促進腫瘤細胞凋亡、阻滯細胞周期及抑制血管生成等作用達到抗腫瘤目的。從月見草脫脂種子中提取的原花青素，用于人乳腺癌細胞株（MDA-MB-231）培養(yǎng)72h后，癌細胞存活率降低50%，侵染力降低65%，原花青素通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和轉(zhuǎn)錄因子c-Fos、c-Jun的表達水平，加速乳腺癌細胞凋亡、抑制乳腺癌細胞的侵染力。采用H22細胞建立小鼠肝癌異種移植模型，連續(xù)10d采用不同濃度葡萄原花青素作用后測定VEGF和腫瘤微血管密度，發(fā)現(xiàn)兩者存在正相關(guān)，且都隨著原花青素濃度增加而降低。

7. 其他活性

原花青素還被報道具有其他活性，如抗菌、抗病毒、抗炎，治療干眼癥、白內(nèi)障等作用。密羅木中的原花青素被報道具有較強的抗單純皰疹病毒活性，可直接與病毒包膜相互作用，衛(wèi)矛科植物中的原花青素被報道具有較強的抗艾滋病病毒活性。發(fā)現(xiàn)葡萄籽原花青素通過激活過氧化酶活化增生受體γ抗體和抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物受體的表達，抑制炎癥因子表達，并保護內(nèi)皮細胞。原花青素在眼部疾病治療中有良好的作用，如緩解干眼癥、抑制白內(nèi)障發(fā)生，還可用于治療視網(wǎng)膜疾病、角膜疾病等。

吸收代謝^[2]

原花青素的吸收代謝已受到越來越多的重視，此方面研究有利于促進原花青素的開發(fā)應(yīng)用。對原花青素的吸收代謝主要集中在體外的Caco-2細胞模型研究和體內(nèi)代謝研究。

1. Caco-2細胞模型

Caco-2細胞模型作為研究表皮細胞藥物轉(zhuǎn)運和代謝的體外模型已被廣泛應(yīng)用于口服藥物的篩選和研究藥物腸吸收過程中，也常用于原花青素的吸收代謝研究。如采用該方法研究可可中原花青素吸收，發(fā)現(xiàn)糖蛋白阻礙原花青素的吸收，并檢測到原花青素B2產(chǎn)生少量的代謝產(chǎn)物表兒茶素、3’-O-表兒茶素和4’-O-表兒茶素。使用Caco-2細胞模型測定可可中3種原花青素（兒茶素、表兒茶素和原花青素B2），認為它們通過細胞旁路轉(zhuǎn)運。利用該方法探討山楂中不同聚合度原花青素的腸道吸收機制，發(fā)現(xiàn)山楂原花青素混合物之間沒有促進滲透作用或協(xié)同效應(yīng)。使用人類腸道上皮分化Caco-2細胞模型結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，檢測蔓越莓中A型原花青素，發(fā)現(xiàn)在蔓越莓所含的A型原花青素二聚體、三聚體和四聚體均可以被人體吸收。

毒理學(xué)研究^[2]

原花青素是一類廣泛分布于自然界的物質(zhì)，具有很強的生物活性，現(xiàn)代毒理學(xué)研究表明該類成分安全性良好。采用犬和小鼠為觀察對象，給予葡萄籽提取物，動物行為、進食量等均未見異常，血液學(xué)指標、血液生化指標和尿液指標、病理組織學(xué)檢查未見異常改變，心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)無明顯不良影響。急性毒性和長期毒性實驗證實葡萄籽原花青素可以安全應(yīng)用。

制備^[1]

一種從葡萄籽中高效低耗提取原花青素的工藝方法，具體包括以下提取分離過程：

一、使用榨汁機對新鮮的葡萄籽進行榨汁，并使用超臨界二氧化碳萃取法除去榨汁得到的葡萄籽渣料中的油脂，使用200目的紗布進行過濾，以收集富含原花青素的葡萄籽渣料；超臨界二氧化碳萃取過程：靜態(tài)夾帶劑為50％的乙醇，超臨界萃取溫度為35℃，超臨界萃取壓力為26MPa，超臨界萃取時間為20min；

二、以65％的乙醇作為提取液，對所述富含原花青素的葡萄籽渣料進行超聲波提取，并使用300目的紗布進行過濾，以收集富含原花青素的提取液；超聲波提取過程為：超聲波功率為280W，超聲波提取次數(shù)為三次，次超聲波提取的超聲波時間為8.5min，第二次超聲波提取的超聲波時間為5.5min，第三次超聲波提取的超聲波時間為3.5min；

三、對所述富含原花青素的提取液進行純化：使用SP825大孔吸附樹脂對所述富含原花青素的提取液進行吸附一段時間，吸附時間為1.1小時；使用pH值為1.5的酸水溶液對吸附有富含原花青素的提取液的大孔吸附樹脂進行洗滌至洗滌液澄清，再使用純化水對所述大孔吸附樹脂進行沖洗；依次使用15％乙醇、20％乙醇、25％乙醇及30％乙醇對SP825大孔吸附樹脂進行洗脫，并將收集的不同梯度的洗脫液進行混合；對混合后的不同梯度的洗脫液進行減壓濃縮，從而得到原花青素浸膏。

四、使用微波干燥法對所述原花青素浸膏進行干燥，得到原花青素粉末。

該實施從葡萄籽中提取得到的原花青素的提取純度為99.8％，提取率為92％。

主要參考資料

[1] 營養(yǎng)科學(xué)詞典

[2] 原花青素的研究進展

[3] CN201710980658.7一種從葡萄籽中高效低耗提取原花青素的工藝方法