背景及概述^[1]

堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase，簡稱ALP或AKP)為一類磷酸酯酶，廣泛分布于哺乳動(dòng)物組織內(nèi)，其活性所需最適pH9.2~9.8。此酶主要存在于物質(zhì)交換活躍之處(細(xì)胞膜)，如腸上皮和腎近曲小管的刷狀緣、附睪上皮之靜纖毛、肝的毛細(xì)膽管膜以及微動(dòng)脈和毛細(xì)血管動(dòng)脈部之內(nèi)皮，還見于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體、吞飲小泡、腸上皮之溶酶體、中性粒細(xì)胞之中性顆粒以及平滑肌之細(xì)胞膜。堿性磷酸酶染色液(偶氮偶聯(lián)法)不是采用金屬沉淀法來顯示堿性磷酸酶活性，而是采用偶氮偶聯(lián)法(又稱同時(shí)偶聯(lián)法)，其原理是在pH9.2～9.8的堿性條件下，細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶可使AB-BI磷酸鹽水解，釋放出磷酸不萘酚，后者不偶聯(lián)重氮鹽生成有色產(chǎn)物，定位于細(xì)胞質(zhì)中。堿性磷酸酶染色液(偶氮偶聯(lián)法)可用于血液、骨髓或細(xì)胞涂片、冰凍切片、梯度入水后的石蠟切片等的堿性磷酸酶染色，堿性磷酸酶活性部位呈藍(lán)色，位于胞槳，結(jié)果較金屬鹽沉淀法可靠。

組成^[1]

操作步驟^[1]

一、涂片或切片

1、血液、骨髓或細(xì)胞涂片、冰凍切片、石蠟切片入ALP固定液固定3min(梯度入水后的石蠟切片無需固定)，水洗。

2、滴加配制好的堿性磷酸酶染色液(偶氮偶聯(lián)法)，放入濕盒中，避光孵育15～20min，水洗。

3、入核固紅染色液或甲基綠染色液復(fù)染3～5min。

4、水洗、鏡檢或甘油明膠封固后鏡檢。

二、貼壁培養(yǎng)細(xì)胞

1、取6孔板或其他容器培養(yǎng)的細(xì)胞，棄液，PBS清洗干凈

2、加入堿性磷酸酶染色液(偶氮偶聯(lián)法)固定3min或4%多聚甲醛固定10～15min，PBS清洗。

3、滴加配制好的堿性磷酸酶染色液(偶氮偶聯(lián)法)，放入濕盒中，避光孵育15～20min，PBS清洗。

4、入核固紅染色液或甲基綠染色液復(fù)染3～5min。

5、PBS清洗、鏡檢。

染色結(jié)果^[1]

ALP活性部位藍(lán)色

細(xì)胞核紅色(核固紅)或綠色(甲基綠)

血液、骨髓涂片

注意事項(xiàng)^[1]

1.血液或骨髓細(xì)胞涂片或其他樣本均應(yīng)新鮮，薄厚適宜，及時(shí)固定，否則會(huì)影響酶的活性。

2.培養(yǎng)細(xì)胞染色操作過程中，清洗、染色等步驟都應(yīng)輕微，以免損傷或丟失細(xì)胞。

3.ALP孵育液易失效或降低陽性強(qiáng)度，即配即用，不宜久置。

4.復(fù)染時(shí)，核固紅染色液或甲基綠染色液二者取其一。

5.每次染色時(shí)，應(yīng)有陽性對照片。

主要參考資料

[1]堿性磷酸酶染色液(偶氮偶聯(lián)法)操作說明