WESTERN及IP細(xì)胞裂解液(無抑制劑)產(chǎn)品說明^[1]

多種成分均可以從細(xì)胞中提取總蛋白，如Triton、SDS、NP-40等，Western 及IP細(xì)胞裂解液是采用一種非變性裂解方法來裂解細(xì)胞，并獲得總蛋白的裂解液。所獲得的蛋白質(zhì)可以用于PAGE電泳，Western, 免疫沉淀(Immunol Precipitation， IP)和免疫共沉淀(co-IP)等，主要由Tris-HCl、NaCl、低濃度Triton X- 100，低濃度 sodium pyrophosphate 等組成，不含蛋白酶、磷酸酶抑制劑，并維持原有的蛋白間相互作用。用 Western及IP細(xì)胞裂解液(無抑制劑) (Cell lysis buffer for Western and IP without inhibitors) 得到的蛋白，可以用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。由于含有較高濃度的TritonX-100等干擾物質(zhì)，不宜用Bradford法測(cè)定由Western及IP細(xì)胞裂解液獲得樣本的蛋白濃度。

操作步驟^[1]

(一)貼壁培養(yǎng)細(xì)胞

1、取Western及IP細(xì)胞裂解液室溫溶解混勻，根據(jù)需要選擇添加或不添加蛋白酶抑制劑。

2、去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液，用PBS、NS或無血清培養(yǎng)液清洗1次，低速離心，棄上清，留取沉淀。

3、按照6孔板每孔加入100~ 200L裂解液的比例，加入Western及IP細(xì)胞裂解液。移液器輕輕吹打，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常裂解液作用于細(xì)胞1~5s內(nèi)，細(xì)胞就會(huì)被裂解。

4、10000~12000g，離心3~ 5min(如果用冷凍離心機(jī)4℃離心效果更佳)，取上清。

5、進(jìn)行后續(xù)的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(二)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞

1、取Western及IP細(xì)胞裂解液室溫溶解混勻，根據(jù)籍要選擇添加或不添加蛋白酶抑制劑。

2、低速離心懸浮細(xì)胞，棄上清，收集沉淀。

3、用手指輕彈細(xì)胞，使其松散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入100~ 200L裂解液的比例，加入Western及IP細(xì)胞裂解液。通常6孔板每孔細(xì)胞加入100噸裂解液已經(jīng)足夠，但如果

細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到150~-200，再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。

4、10000~12000g， 4C離心3~5min (如無低溫離心機(jī)，空溫下離心亦可)，取上清。

5、進(jìn)行后續(xù)的PAGE、 Western. 免疫沉淀等操作。

主要參考文獻(xiàn)

[1] 張華昌，PTEN基因在唾液腺腺樣囊性癌中的表達(dá)研究。《重慶醫(yī)科大學(xué)》