背景[1-3]
人胱抑素C(CYSC)ELISA KIT應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中人胱抑素C（CysC）水平。用純化的人胱抑素C（CysC）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入胱抑素C（CysC），再與HRP標(biāo)記的羊抗人抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的胱抑素C（CysC）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人胱抑素C（CysC）濃度。
胱抑素C（Cystatin C，CYSC）是一種堿性分糖化的分泌性蛋白質(zhì)，屬于半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族，分子量為13.3kDa。所有有核細(xì)胞都能夠生產(chǎn)CYSC，其產(chǎn)生率恒定，分泌及排泄均不受任何外來因素的影響，如性別、年齡、飲食等。腎臟是清除循環(huán)中CYSC的惟一器官，且CYSC生成速度及其在血液中含量都相對(duì)穩(wěn)定，受其他因素影響較小。因此CYSC是反映早期腎小球?yàn)V過率變化（glomerular filtration rate，GFR）理想、可靠的內(nèi)源性標(biāo)志物。FDA指出該指標(biāo)較尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）有更高的敏感性和特異性，強(qiáng)調(diào)該項(xiàng)目應(yīng)該在全球范圍內(nèi)推廣。正常情況下，CYSC在血清和血漿中的濃度為0.51-1.09mg/L（參考范圍）。當(dāng)腎功能受損時(shí)，CYSC在血液中的濃度隨腎小球?yàn)V過率變化而變化。腎衰時(shí)，腎小球?yàn)V過率下降，CYSC在血液中濃度可增加10多倍；若腎小球?yàn)V過率正常，而腎小管功能失常時(shí)，會(huì)阻礙CYSC在腎小管處的吸收和分解，使尿中的濃度增加100多倍。
應(yīng)用[4][5]
人胱抑素C(CYSC)ELISA KIT用于人胱抑素C可溶性表達(dá)、多克隆抗體制備及檢測(cè)方法建立研究。
胱抑素C（Cystatin C，CysC）即半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白C，是一種非糖基化的堿性低分子量蛋白質(zhì)。該蛋白能夠在所有有核細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，幾乎不受年齡、性別、體重、感染、飲食、體表面積等因素的影響。胱抑素C是迄今為止基本能夠滿足腎小球?yàn)V過率（GFR）理想內(nèi)源性標(biāo)志物要求的物質(zhì)，對(duì)于早期腎功能損傷的診斷和治療具有重要意義。其檢測(cè)方法主要是免疫學(xué)法，但目前國(guó)內(nèi)CysC診斷試劑及標(biāo)準(zhǔn)品主要由國(guó)外公司提供，價(jià)格昂貴，使病人和社會(huì)醫(yī)療成本較高。因此，胱抑素C免疫診斷試劑盒的自主研發(fā)具有重要的價(jià)值和意義。用Trx-CysC作為免疫原免疫新西蘭大白兔獲得CysC的多克隆抗體，建立CysC顆粒增強(qiáng)透射免疫比濁法（particle enhanced turbidimetric immunoassay，PETIA）并進(jìn)行初步方法學(xué)評(píng)價(jià)，為該方法的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
方法：1.在不改變氨基酸序列的前提下，對(duì)CysC的全長(zhǎng)編碼基因進(jìn)行大腸桿菌同義密碼子偏好性優(yōu)化后人工合成其序列，并插入原核表達(dá)載體pET32（a+），構(gòu)建CysC優(yōu)化后的原核表達(dá)質(zhì)粒pET32（a+）-CysC。經(jīng)測(cè)序鑒定正確后，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)重組蛋白可溶性表達(dá)并純化獲得Trx-CysC。2.從HL60細(xì)胞株提取總RNA，行RT-PCR獲得cDNA模板，再經(jīng)高保真PCR獲得CysC的DNA片段。將該人CysC的全長(zhǎng)編碼基因插入原核表達(dá)載體pCold TF,構(gòu)建CysC原核表達(dá)質(zhì)粒pCold TF-CysC。待測(cè)序結(jié)果與預(yù)期相符后，將該重組質(zhì)粒pCold TF-CysC轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)并純化獲得可溶性重組蛋白TF-CysC。利用GST-HRV3C蛋白酶切除該融合蛋白的TF標(biāo)簽，再經(jīng)分子篩去除TF標(biāo)簽、3C蛋白酶獲得無蛋白標(biāo)簽的CysC，SDS-PAGE鑒定其純度。3.用純化的重組蛋白Trx-CysC作為免疫原免疫新西蘭大白兔，經(jīng)蛋白A柱純化制備CysC多克隆抗體。
參考文獻(xiàn)
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