背景[1-3]
COLO205細胞是1957年由T.U.Sample等從患有結腸癌的70歲男性白人的腹水中分離的。該病人在取腹水樣品前已用5-氟尿嘧啶治療4~6周。角蛋白免疫過氧化物酶染色陽性。
COLO205人結腸癌細胞培養(yǎng)操作
1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為類；
1.細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。
2.4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細胞，根據(jù)細胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細胞懸液，注意凍存管做好標識。
3.將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個小時以后轉入液氮灌儲存。
應用[4][5]
用于shRNA介導PIAS3表達下調對人結腸癌COLO205細胞增殖和凋亡的影響研究
檢測取自人體不同部位、不同Dukes分期的人結腸癌細胞株SW480(取自結腸癌組織,Dukes B期)、SW620(取自結腸癌淋巴轉移組織,Dukes C期)及COLO205(取自結腸癌腹腔轉移腹水組織,Dukes D期)中PIAS3的表達水平,篩選PIAS3相對高表達細胞株進行shRNA質粒轉染干預實驗。
通過轉染PIAS3shRNA質粒,下調結腸癌細胞株中PIAS3基因的表達水平,研究該基因的差異性表達對結腸癌細胞增殖活性、凋亡和細胞周期的影響。
方法：運用實時熒光定量PCR(Real-TimePCR)及蛋白免疫印跡(Western blot)檢測SW480、SW620及COLO205三種入結腸癌細胞株中PIAS3基因的表達水平；運用脂質體介導將PIAS3shRNA質粒及無關序列shRNA對照質粒轉染入人結腸癌細胞株,干預后區(qū)分為：PIAS3shRNA轉染組(轉染PIAS3shRNA質粒)、無關序列shRNA轉染組(轉染無關序列對照質粒)及空白對照組(不進行轉染干預)。
采用Real-Time PCR.Western blot檢測質粒轉染干預對PIAS3基因的抑制效果；MTT(噻唑藍)法檢測PIAS3表達下調對結腸癌細胞增殖活性的影響；流式細胞儀檢測PIAS3表達下調對人結腸癌細胞周期和凋亡的影響。
參考文獻
[1]Molecular analysis of functional redundancy among anti-apoptotic Bcl-2 proteins and its role in cancer cell survival[J].Joshua M.Eichhorn,Sarah E.Alford,Nandini Sakurikar,Timothy C.Chambers.Experimental Cell Research.2014(2)
[2]PIAS3 activates the intrinsic apoptotic pathway in non‐small cell lung cancer cells independent of p53 status[J].Snehal Dabir,Amy Kluge,Karen McColl,Yu Liu,Minh Lam,Balazs Halmos,Gary Wildey,Afshin Dowlati.Int.J.Cancer.2014(5)
[3]Alloprimed CD8+T Cells Regulate Alloantibody and Eliminate Alloprimed B Cells Through Perforin‐and FasL‐Dependent Mechanisms[J].J.M.Zimmerer,T.A.Pham,C.L.Wright,K.J.Tobin,P.B.Sanghavi,S.M.Elzein,V.M.Sanders,G.L.Bumgardner.American Journal of Transplantation.2014(2)
[4]miR-125b Inhibitor May Enhance the Invasion-Prevention Activity of Temozolomide in Glioblastoma Stem Cells by Targeting PIAS3[J].Lei Shi,Yi Wan,Guan Sun,Shuguang Zhang,Zhimin Wang,Yanjun Zeng.BioDrugs.2014(1)
[5]李和平.shRNA介導PIAS3表達下調對人結腸癌COLO205細胞增殖和凋亡的影響[D].新疆醫(yī)科大學,2014.