背景[1-3]
小鼠冠狀動脈平滑肌細胞分離自冠狀動脈組織采用胰蛋白酶-膠原酶聯(lián)合消化法結合差速貼壁法制備而來。
冠狀動脈是供給心臟血液的動脈，起于主動脈根部，分左右兩支，行于心臟表面。采用Schlesinger等的分類原則，將冠狀動脈的分布分為三型：右優(yōu)勢型、均衡型、左優(yōu)勢型。左右冠狀動脈是升主動脈的對分支。
小鼠冠狀動脈平滑肌細胞
左冠狀動脈為一短干，發(fā)自左主動脈竇，經肺動脈起始部和左心耳之間，沿冠狀溝向左前方行后，立即分為前室間支和旋支。前室間支沿前室間溝下行，旋支繞過心尖切跡至心的膈面與右冠狀動脈的后室間支相吻合。
它是構成冠狀動脈壁的主要細胞成分，細胞膜上分布著多種離子通道，如電壓依賴性Na+通道、多種Ca2+通道和K+通道；它們參與了靜息電位的維持與細胞膜電位的復極化、超極化，調節(jié)血管平滑肌的收縮及舒張功能，此外動脈粥樣硬化的發(fā)展也涉及冠狀動脈平滑肌細胞增殖、炎癥及凋亡等。
因此，原代分離培養(yǎng)的冠狀動脈平滑肌細胞，對研究生理和病理狀態(tài)下離子通道及血管張力變化機制具有非常重要的作用。
冠狀動脈平滑肌細胞原代分離培養(yǎng)3天后，可見細胞貼壁伸展，細胞形態(tài)大小不一，呈梭形、不規(guī)則形、三角形或扇形，核卵圓形、居中；2周后細胞匯合，多數細胞伸展呈長梭形，胞漿豐富，有分枝狀突起，細胞平行排列成單層或部分區(qū)域多層重疊生長，高低起伏；細胞密度低時，常交織成網狀；密度高時，則排列為旋渦狀或柵欄狀。傳代后細胞生長較快，4-6天即可匯合，并保持上述形態(tài)學特征和生長特點。
應用[4][5]
用于心臟血管發(fā)育及畸形糾正的基礎性研究
研究發(fā)現(xiàn)Wdpcp基因對于冠狀動脈的發(fā)育亦不可或缺。通過SM22α示蹤冠脈平滑肌細胞,發(fā)現(xiàn)Wdpcp純合突變小鼠的冠狀動脈分支減少,平滑肌細胞數量明顯下降,而冠狀靜脈的發(fā)育基本不受影響。
PECAM免疫組化染色顯示Wdpcp基因缺失并不影響冠脈血管叢的形成,相比野生型小鼠血管叢的形成速度反而加快。采用Wt1CreERT2-Rosa26mTmG系統(tǒng)示蹤心外膜細胞,結果顯示Wdpcp純合突變小鼠胚胎的心外膜來源細胞（EPDCs）相比野生型小鼠顯著減少,qPCR分析顯示Snail2,Twist1等EMT調節(jié)基因和Vinculin,Vimentin等間充質干細胞標志基因表達明顯降低。
3D膠原凝膠實驗證明Wdpcp純合突變小鼠的EPDCs其遷移能力相比野生型小鼠明顯下降。進一步在小鼠中特異性敲除心外膜細胞的Wdpcp基因,其冠脈缺陷表型與Wdpcp純合突變小鼠相似。
以上結果證明Wdpcp通過促進心外膜細胞的上皮-間充質轉化（EMT）和遷移過程在冠脈血管叢的重塑階段發(fā)揮作用。
研究首次呈現(xiàn)了一個在冠脈血管叢重塑而非形成過程中發(fā)生缺陷的小鼠模型,將為冠脈血管叢重塑過程中的分子機制研究提供幫助。22q11.2微缺失綜合征（22q11.2DS）是臨床上最常見的染色體微缺失綜合征,常見臨床癥狀有心血管畸形、頭面部畸形、胸腺/甲狀旁腺發(fā)育不良等,其中心血管畸形主要表現(xiàn)為法氏四聯(lián)征、法氏四聯(lián)征合并肺動脈閉鎖,另外的類型有主動脈弓離斷、右室雙出口和永存動脈干等。
其致病基因主要是由于T盒轉錄基因TBX1的單倍體不足。在合作者Baldini教授實驗室在前期實驗中發(fā)現(xiàn)Tbx1可通過招募甲基化轉移酶增強組蛋白3賴氨酸4的單甲基化（H3K4me1）從而調控基因轉錄。
在此工作基礎上,以Tbx1LacZ/+、Tbx1Neo2/LacZ突變小鼠為研究對象,檢測組蛋白去甲基化酶抑制劑TCP能否糾正Tbx 1缺失造成的心血管畸形。腹腔注射TCP,收取胚胎10.5天Tbx1LacZ/+突變小鼠,通過墨汁注射觀察第Ⅳ咽弓動脈形態(tài),發(fā)現(xiàn)其缺陷比例下降;收取胚胎18.5天Tbx1Neo2/LacZ突變小鼠,觀察心臟流出道形態(tài),發(fā)現(xiàn)TCP可部分糾正永存動脈干畸形,但并不能糾正胸腺缺失的表型。
qRT-PCR分析顯示Tbx1的表達量在TCP處理組和PBS對照組無顯著差別,說明TCP并非通過上調Tbx1基因本身的表達量起作用。
原位雜交實驗證明TCP處理后第二心域細胞（SHF）Fgf8的表達增加,與該結果一致的是,增殖相關基因Cyclin D2在SHF細胞表達增加,增殖相關蛋白PHH3磷酸化水平提高。且TCP處理后SHF極性缺失程度減輕,αPKCζ熒光信號重新趨向細胞頂端分布。
參考文獻
[1]Coronary Artery Development:Progenitor Cells and Differentiation Pathways[J].Bikram Sharma,Andrew Chang,Kristy Red-Horse.Annual Review of Physiology.2017
[2]Transcriptomic Profiling Maps Anatomically Patterned Subpopulations among Single Embryonic Cardiac Cells[J].Guang Li,Adele Xu,Sopheak Sim,James R.Priest,Xueying Tian,Tooba Khan,Thomas Quertermous,Bin Zhou,Philip S.Tsao,Stephen R.Quake,Sean M.Wu.Developmental Cell.2016(4)
[3]Endocardium Minimally Contributes to Coronary Endothelium in the Embryonic Ventricular Free Walls[J].Hui Zhang,Wenjuan Pu,Guang Li,Xiuzhen Huang,Lingjuan He,Xueying Tian,Qiaozhen Liu,Libo Zhang,Sean M.Wu,Henry M.Sucov,Bin Zhou.Circulation Research.2016
[4]The CXCL12/CXCR4 Axis Plays a Critical Role in Coronary Artery Development[J].Sarah Ivins,Joel Chappell,Bertrand Vernay,Jenifer Suntharalingham,Alexandrine Martineau,Timothy J.Mohun,Peter J.Scambler.Developmental Cell.2015(4)
[5]劉向陽.心臟血管發(fā)育及畸形糾正的基礎性研究[D].上海交通大學,2018.