背景[1-3]
植物細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒可以將質(zhì)粒、Cas9/sgRNA等蛋白和RNA轉(zhuǎn)染進入植物原生質(zhì)體內(nèi)。經(jīng)轉(zhuǎn)染的植物原生質(zhì)體經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后，可用于檢測外源基因的表達和功能、也可以觀測到目的基因的表達調(diào)控。
植物原生質(zhì)體通常是指植物細(xì)胞去除細(xì)胞壁后，由質(zhì)膜所包圍的部分細(xì)胞物質(zhì)。由于其擁有無細(xì)胞壁的物理障礙、具有全能性、組織培養(yǎng)可進行大量繁殖等特點，原生質(zhì)體是開展一系列植物細(xì)胞研究的重要材料。
以擬南芥原生質(zhì)體為例，使用本試劑盒轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，通常2-6小時就可以檢測到相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄變化；2-16小時后可以檢測到相關(guān)蛋白表達的變化；24小時后則可以檢測到基因編輯情況。
植物細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒
轉(zhuǎn)染原理：
本試劑盒采用優(yōu)化后的聚乙二醇轉(zhuǎn)染方法，借助聚乙二醇短時間內(nèi)對原生質(zhì)體產(chǎn)生的沖擊效應(yīng)，使質(zhì)粒DNA、RNA或蛋白能夠進入原生質(zhì)體，不僅使用起來十分便捷，同時還具有超高的轉(zhuǎn)染效率.
使用方法：
在2ml的圓底離心管中加入20μg p35SPPDK-EGFP-Flag(植物用綠色熒光蛋白)，加入100μl制備好的原生質(zhì)體，輕柔混勻后加入110μl當(dāng)日配制好的轉(zhuǎn)染試劑溶液，輕柔混勻，室溫靜置5min后加入440μl終止液，輕輕顛倒混勻，室溫100g離心1min，去除上清，再加入0.5ml終止液，輕柔重懸原生質(zhì)體，室溫100g離心1min后，盡量去除上清，收集原生質(zhì)體。加入1ml培養(yǎng)液，小心重懸原生質(zhì)體后將其平置25℃培養(yǎng)過夜(約16h)，次日于熒光顯微鏡下檢測EGFP熒光信號。
應(yīng)用[4][5]
用于腸出血性大腸桿菌O157：H7植物疫苗的研究
通過對生菜中表達的來源于E.coli O157:H7的EspA生物學(xué)特性的研究,證實了大腸桿菌的EspA可以作為植物疫苗研究中的免疫原。
首次在植物細(xì)胞內(nèi)進行了E.coli O157:H7表面蛋白EspA的瞬時表達及穩(wěn)定表達研究,并分別對以兩種體系中表達的重組蛋白進行了動物實驗。實驗通過試驗小鼠的多克隆EspA抗體的體內(nèi)及體外保護性試驗,證實了免疫試驗小鼠產(chǎn)生的多克隆EspA抗體的對HeLa細(xì)胞的保護性作用,并通過E.coli O157:H7⊿stx-B突變株的小鼠攻毒后的腸道病理研究發(fā)現(xiàn)EspA免疫后的小鼠具有對E.coli O157:H7⊿stx-B的抵抗力。
在生菜中采用瞬時表達體系表達了E.coli O157:H7的EspA蛋白。將構(gòu)建好的pBI121-espA,pBI121-ΩespA載體通過液氮凍融法分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌AGL1,EHA105,LBA4404,GV3101和C58C1后,將帶有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌在卡那抗性和利福平抗性的YEB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng),采用真空法轉(zhuǎn)染培養(yǎng)14天的無菌生菜小苗,轉(zhuǎn)染生菜在22℃培養(yǎng)3天后,檢測各菌株轉(zhuǎn)染生菜后EspA的表達水平。
試驗發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌AGL1轉(zhuǎn)染的生菜中EspA的表達量最高,農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)染的生菜的EspA的量最低,通過檢測pBI121-espA和pBI121-ΩespA轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101后通過真空法轉(zhuǎn)染生菜,發(fā)現(xiàn)pBI121-ΩespA組具有比較高的EspA表達量,通過對瞬時體系中重組蛋白的表達研究,確定了不同農(nóng)桿菌菌株在生菜瞬時表達系統(tǒng)中的不同的轉(zhuǎn)染能力,這是首次在生菜瞬時表達的系統(tǒng)中進行此類綜合研究。
通過免疫小鼠的實驗證實生菜細(xì)胞內(nèi)瞬時表達的EspA能夠刺激小鼠產(chǎn)生高水平的IgG和IgA抗體,這是首次關(guān)于植物表達E.coli O157:H7的主要免疫原EspA的疫苗報道。
參考文獻
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[5]欒婧婧.腸出血性大腸桿菌O157：H7植物疫苗的研究[D].山東大學(xué),2009.