背景[1-3]
人骨肉瘤細胞是從一名13歲的白人女性的骨肉瘤組織中分離建立的；HOS細胞表現為扁平形態(tài)、低飽和密度、軟瓊脂中的低克隆形成率和對化合物及病毒感染的敏感性。
人骨肉瘤細胞
細胞培養(yǎng)步驟
一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：
1）準備MEM培養(yǎng)基(MEM，GIBCO)，90%；胎牛血清，10%。
2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%完全培養(yǎng)基，10%DMSO，現用現配。液氮儲存。
二．細胞處理：
1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。貼壁細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細胞變圓脫落后，加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中，再添加10%DMSO后進行凍存。
應用[4][5]
用于人參皂苷Rg3抑制人骨肉瘤細胞增殖及其分子機制研究
人參皂苷Rg3的甾體結構使得它可以與細胞膜、膜結合離子通道、以及胞內和胞外的受體相互作用來改變細胞的轉錄水平以來發(fā)揮抗腫瘤作用。
研究方法:本實驗應用MTT實驗、流式細胞術、細胞劃痕實驗、Transwell細胞侵襲實驗檢測了人參皂苷Rg3對骨肉瘤細胞系MG-63、HOS和U2OS增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響和對細胞周期作用。又進一步選擇MG-63細胞作為研究對象,應用western blot、定量PCR、流式細胞術、小干擾RNA等實驗手段進一步探究人參皂苷Rg3誘導細胞自噬、凋亡以及細胞周期阻滯的具體作用機制。
實驗結果:MTT實驗發(fā)現人參皂苷Rg3以劑量依賴的方式抑制三種骨肉瘤細胞系MG-63、HOS以及U2OS的增殖。流式細胞術則驗證人參皂苷Rg3的促三種肉瘤細胞系的凋亡。
細胞劃痕實驗和Transwell細胞侵襲實驗驗證了人參皂苷Rg3可以抑制三種骨肉瘤細胞系的遷移和侵襲。WB實驗發(fā)現經人參皂苷Rg3處理的的骨肉瘤細胞MG-63中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的水平與未加藥的對照組相比有顯著性地升高。Western blot和定量PCR證實人參皂苷Rg3組caspase-3的基因和蛋白表達水平增加,流式細胞術證實人參皂苷Rg3組細胞凋亡水平升高。
而當使用代表性自噬通路抑制劑3-MA和人參皂苷Rg3同時作用于MG-63細胞時,WB實驗和定量PCR顯示3-MA可以顯著逆轉由人參皂苷Rg3導致的細胞凋亡和自噬相關蛋白的轉錄和表達水平的變化。
而用小干擾RNA技術沉默LC3基因可以顯著逆轉人參皂苷Rg3導致的MG-63細胞的凋亡和遷移侵襲受限。WB實驗顯示人參皂苷Rg3可以使p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTORC1/mTORC1表達水平降低,而LC3/β-actin的表達水平增高,而加入PI3K激動劑IGF-1則可以逆轉人參皂苷Rg3導致的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTORC1/mTORC1和LC3/β-actin表達水平的變化。
流式細胞術檢驗經人參皂苷Rg3處理的骨肉瘤細胞系MG-63、HOS、U2OS處于G0/G1的細胞的比例上升,處于S期的細胞比例下降。WB實驗結果顯示人參皂苷Rg3處理的MG-63細胞中cyclinA、cyclinB的表達未見明顯改變,而cyclinD1、CDK-4以及CDK-6的表達量顯著下降,上游調節(jié)因子p53、p21的表達量顯著上升。
參考文獻
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[3]Progress in the chemotherapeutic treatment of osteosarcoma（Review）[J].Ya Zhang,Jingqing Yang,Na Zhao,Cao Wang,Santosh Kamar,Yonghong Zhou,Zewei He,Jifei Yang,Bin Sun,Xiaoqian Shi,Lei Han,Zuozhang Yang.Oncology Letters.2018(5)
[4]Modulating autophagy in cancer therapy:Advancements and challenges for cancer cell death sensitization[J].Punya Bhat,Jurgen Kriel,Babu Shubha Priya,Basappa,Nanjunda Swamy Shivananju,Ben Loos.Biochemical Pharmacology.2018
[5]劉明陽.人參皂苷Rg3抑制人骨肉瘤細胞增殖及其分子機制研究[D].吉林大學,2020.