背景[1-3]
人抗乙型肝炎病毒表面抗體(HBSAB)ELISA KIT可以用于檢測各種樣本中人抗乙型肝炎病毒表面抗體(HBSAB)的含量。
原理：試劑盒采用間接法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被人抗乙型肝炎病毒表面抗體（HBsAb）捕獲抗原的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人抗乙型肝炎病毒表面抗體（HBsAb）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
人抗乙型肝炎病毒表面抗體(HBSAB)ELISA KIT
樣品收集、處理及保存方法
1.血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2.血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。
3.細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4.組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。
操作步驟
1. 從室溫平衡60min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2. 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；
3. 待測樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；
4. 隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。
6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。
結(jié)果判斷
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。
應(yīng)用[4][5]
用于人源抗乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）基因工程抗體的研究
目前應(yīng)用于臨床的高效價免疫球蛋白（HBIG）采用健康人即抗-HBsAg陽性的人血制備的,可以中和并清除侵入人體的乙肝病毒,使機(jī)體免受乙肝病毒的感染。由于血源來源有限、制備成本高且存在病原體潛在感染的危險,限制了其在臨床上的應(yīng)用。抗體庫技術(shù)能夠篩選出高親和力的特異性單克隆抗體,從而使大規(guī)模生產(chǎn)人源化乙肝抗體成為可能。
基于此,研究中篩選人源抗HBsAg抗體包括以下三部分內(nèi)容：一、人源抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab噬菌體抗體庫的構(gòu)建和篩選選取5名乙肝表面抗體（HBsAb+）陽性的健康志愿者,接種國產(chǎn)乙肝疫苗進(jìn)行加強免疫,兩周后采集志愿者外周血并分離出淋巴細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA,使用Oligo dT引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,利用特異性的8對Lambda輕鏈子庫引物、5對Kappa輕鏈子庫引物和8對重鏈引物擴(kuò)增出輕重鏈Fd片段,輕鏈和重鏈分別通過SacⅠ/XbaⅠ和Xhol/SpeⅠ酶切位點克隆到pComb3H載體中,成功電轉(zhuǎn)構(gòu)建4個Kappa子庫和Lambda子庫,細(xì)菌抗體庫鑒定結(jié)果表明所構(gòu)建Fab噬菌體抗體庫庫容量達(dá)到3×108以上,抗體基因插入率接近100%,符合篩庫的標(biāo)準(zhǔn)。在成功構(gòu)建了噬菌體抗體庫的基礎(chǔ)上,采用輔助噬菌體VCSM13包裝成Fab噬菌體抗體庫,利用商品化的乙肝表面抗原蛋白對抗體庫進(jìn)行富集篩選。并通過序列測定確定所獲各株抗體的基因序列,與v-base database中抗體序列信息進(jìn)行比較,確定其CDR區(qū)。序列測定結(jié)果顯示共有20株輕重鏈系列均不相同的克隆株,通過ELISA實驗證明這些抗體均為特異性HBsAg抗體,通過競爭性ELISA發(fā)現(xiàn)20株抗體可以競爭結(jié)合3個不同表位。
二、人源抗乙型肝炎病毒表面抗原全抗體表達(dá)及功能鑒定在利用原核細(xì)胞XL1-Blue表達(dá)Fab抗體的基礎(chǔ)上,分別利用哺乳動物瞬時表達(dá)系統(tǒng)和桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞技術(shù)平臺實現(xiàn)了全抗體的真核分泌表達(dá)。將篩選出的20株抗體中具有高滴度6株Fab抗體的輕鏈和重鏈Fd段基因插入桿狀病毒載體pAc-L-FcR中,然后將構(gòu)建完成的重組質(zhì)粒與桿狀病毒重組后轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞,同時將其輕重鏈可變區(qū)基因插入HL51-14哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體后,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。通過直接免疫熒光檢測真核表達(dá)效果,收集昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞表達(dá)上清進(jìn)行親和層析純化。利用SDS-PAGE檢測純化后抗體的純度、ELISA方法檢測純化后的抗HBsAgIgG全抗體的功能活性,結(jié)果表明純化后的人源HBsAg單克隆抗體抗體純度達(dá)到98%以上,并且具有良好的生物活性。
三、人源抗乙型肝炎病毒表面抗原IgG全抗體親和力研究將純化后的抗HBsAg IgG全抗體分別利用非競爭性ELISA方法和BIAcoreSPR檢測方法檢測其親和力,結(jié)果顯示含有同一重鏈基因的各株抗體的親和力較高,KD值達(dá)到10-9mol/L（abbr.M）,而兩種表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的同一株抗體的親和力活性無明顯差異。綜上所述,本研究通過基因工程抗體制備技術(shù)平臺,運用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù),從乙肝疫苗加強免疫后的HBsAb+志愿者的外周血中獲得Fab段抗體基因,成功構(gòu)建了人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗體文庫,容量為2×107克隆/ml,輕、重鏈基因插入率均接近100%。用商品化的乙肝病毒表面抗原對Fab噬菌體抗體庫進(jìn)行富集篩選,經(jīng)過特異性ELISA、序列測定證實共獲得了20株特異性針對乙肝病毒表面抗原的人源Fab單抗,滴度測定后選取6株滴度較高的抗體進(jìn)行全抗體表達(dá)。
參考文獻(xiàn)
[1]Epidemiology of Hepatitis Virus B and C[J].Archives of Medical Research.2007(6)
[2]Mechanism of viral persistence and resistance to nucleoside and nucleotide analogs in chronic Hepatitis B virus infection[J].Fabien Zoulim.Antiviral Research.2004(1)
[3]Baculovirus expression cassette vectors for rapid production of complete human IgG from phage display selected antibody fragments[J].Mifang Liang,Stefan Dübel,Dexin Li,Iris Queitsch,Wei Li,Ekkehard K.F Bautz.Journal of Immunological Methods.2001(1)
[4]Efficacy and limitations of a specific immunotherapy in chronic hepatitis B[J].Journal of Hepatology.2001(6)
[5]劉洋.人源抗乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）基因工程抗體的研究[D].中國疾病預(yù)防控制中心,2012.