背景[1-3]
大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞取自SD大鼠的腹股溝脂肪，這些細(xì)胞能夠表達(dá)ADSCs的特定蛋白，貼壁培養(yǎng)后使用帶有GFP基因的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，使細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)GFP。擁有強(qiáng)大的增殖和多向分化能力，可作為細(xì)胞模型應(yīng)用于增殖、衰老、免疫、分化和移植研究。
脂肪組織主要由大量群集的脂肪細(xì)胞構(gòu)成，聚集成團(tuán)的脂肪細(xì)胞由薄層疏松結(jié)締組織分隔成小葉；貯存的脂肪，在需要時(shí)可迅速分解成甘油和脂肪酸，經(jīng)血液輸送到各組織以供利用。它們影響胰島素敏感性、血壓水平、內(nèi)皮功能、纖溶活動(dòng)及炎癥反應(yīng)，參與多種重要病理生理過程；脂肪組織已由過去單純作為能量儲(chǔ)存的器官而成為一個(gè)極其重要的內(nèi)分泌系統(tǒng)。
脂肪組織中也存在一些干細(xì)胞群，具有自我更新能力和多向分化潛能，被稱為脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，簡稱脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，在來源、細(xì)胞群特點(diǎn)以及分化潛能等多方面極為相似。但是，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞更易獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞，且獲取過程中對(duì)機(jī)體損傷更小，是更為理想的自體干細(xì)胞源。
大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞
培養(yǎng)步驟：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕吹打細(xì)胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。
應(yīng)用[4][5]
用于番茄紅素對(duì)氧化應(yīng)激下小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的保護(hù)作用研究
從小鼠腹股溝脂肪中成功分離培養(yǎng)出脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSC）;成功完成ADSC的傳代、凍存及復(fù)蘇;對(duì)ADSC進(jìn)行干性鑒定。
方法:1.根據(jù)I型膠原酶酶消法從小鼠的腹股溝脂肪分離提取ADSC并進(jìn)行體外培養(yǎng);利用胰酶酶消法進(jìn)行細(xì)胞傳代;利用梯度凍存法液氮保存的方法進(jìn)行細(xì)胞凍存;分別利用流式細(xì)胞技術(shù)鑒定ADSC表面標(biāo)志物,利用分化實(shí)驗(yàn)鑒定ADSC的多向分化能力。
2. 利用不同濃度的H2O2對(duì)ADSC進(jìn)行干預(yù),顯微鏡觀察細(xì)胞的生長狀態(tài),利用CCK-8、TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度H2O2對(duì)ADSC的增殖活力及凋亡情況的影響,利用ROS染色技術(shù)觀察不同濃度H2O2對(duì)ADSC產(chǎn)生ROS水平的影響。
3. 利用番茄紅素干預(yù)H2O2誘導(dǎo)的ADSC的氧化應(yīng)激模型,分別利用CCK-8、TUNEL實(shí)驗(yàn)、ROS染色技術(shù)檢測番茄紅素對(duì)氧化應(yīng)激下ADSC的增殖能力的影響,利用ALP染色及活性檢測實(shí)驗(yàn)、茜素紅染色及鈣定量檢測實(shí)驗(yàn)、PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)檢測番茄紅素對(duì)氧化應(yīng)激下ADSC的成骨能力的影響。
結(jié)果:1.所培養(yǎng)的ADSC中間充質(zhì)干細(xì)胞陽性表面標(biāo)志物CD29、CD90表達(dá)率均在90%以上,陰性表面標(biāo)志物CD45表達(dá)率在5%以下;誘導(dǎo)成脂分化行油紅O染色可見橘紅色脂滴;誘導(dǎo)成骨分化行茜素紅染色可見磚紅色鈣結(jié)節(jié)沉積。
2. CCK-8、TUNEL實(shí)驗(yàn)、ROS染色技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)H2O2可以誘導(dǎo)小鼠ADSC產(chǎn)生ROS,并發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),少量的ROS可以促進(jìn)小鼠ADSC的細(xì)胞增殖,過量的ROS會(huì)抑制小鼠ADSC的細(xì)胞增殖,同時(shí)會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
3.CCK-8、TUNEL實(shí)驗(yàn)、ROS染色技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)各組ADSC的增殖率高低次序?yàn)榭瞻讓?duì)照組=番茄紅素組>共處理組>氧化應(yīng)激組,凋亡率及ROS水平高低次序?yàn)檠趸瘧?yīng)激組>共處理組>空白對(duì)照組>番茄紅素組;通過ALP染色及活性檢測實(shí)驗(yàn)、茜素紅染色及鈣定量檢測實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各組ADSC的ALP活性大小為空白對(duì)照組=番茄紅素組>共處理組>氧化應(yīng)激組,各組ADSC的鈣含量大小為番茄紅素組>空白對(duì)照組>共處理組>氧化應(yīng)激組;通過PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)檢測各組ADSC的COL1、OCN及RUNX2的基因及蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)番茄紅素組的成骨相關(guān)的重要基因和蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組明顯升高,氧化應(yīng)激組的基因和蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組明顯下降,共處理組因番茄紅素的干預(yù),各項(xiàng)基因和蛋白表達(dá)水平較氧化應(yīng)激組明顯改善。
參考文獻(xiàn)
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