背景[1-3]
人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞提取于人腦組織，提取純化之后立即凍存。細(xì)胞通過vWF/Factor VIII和CD31(P-CAM)免疫熒光染色驗(yàn)證，經(jīng)測試不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌。
人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞
細(xì)胞培養(yǎng)方法：
1.準(zhǔn)備纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶(2μg/cm2，推薦用T-75的培養(yǎng)瓶)。向培養(yǎng)瓶中加入10 ml無菌Dulbecco's磷酸鹽緩沖液（DPBS），然后加入150μl纖維連接蛋白原液(1 mg/ml,Sigma cat.no.F1141)。將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中孵育過夜。
2.準(zhǔn)備完全培養(yǎng)基：用70%的酒精消毒培養(yǎng)基和添加物的外表面，然后放到無菌的地方。在無菌環(huán)境下打開每一個添加物管并用吸管將其加入到基本培養(yǎng)基中。以保證添加物全部加入基本培養(yǎng)基中。
3.吸出纖維連接蛋白溶液并向瓶內(nèi)加入20 ml完全培養(yǎng)基。將培養(yǎng)瓶放入超凈臺中，然后準(zhǔn)備融化細(xì)胞。纖維連接蛋白溶液可以使用兩次。
4.將小瓶放入37°C水浴中，握住并輕輕旋轉(zhuǎn)小瓶直到其內(nèi)細(xì)胞完全融化。將小瓶立刻移出水浴，擦干，用70%的酒精沖洗小瓶，然后放到無菌環(huán)境中。小心地打開蓋子，注意手指不要碰到里面的螺紋。eppendorf吸管輕輕重懸管內(nèi)容物。
5.將管內(nèi)容物均勻的放入纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶中。推薦的接種密度為7,500 cells/cm2。
注意：不推薦在細(xì)胞融化后進(jìn)行稀釋和離心，因?yàn)檫@些操作比培養(yǎng)基中的DMSO殘留物對細(xì)胞的傷害更大。需要注意的是，內(nèi)皮細(xì)胞接種在纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶中能夠促進(jìn)細(xì)胞的帖壁。
6.蓋好培養(yǎng)瓶的蓋子，輕輕地?fù)u動培養(yǎng)瓶以使細(xì)胞分布均勻，如需氣體交換則適當(dāng)放松瓶蓋。
7.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中。
8.為了得到良好的結(jié)果，在培養(yǎng)開始后至少16個小時內(nèi)不要動培養(yǎng)物。第二天更換培養(yǎng)基以去除殘留的DMSO和未貼壁的細(xì)胞，然后每隔一天進(jìn)行如上操作。培養(yǎng)良好的細(xì)胞將呈現(xiàn)鵝卵石形或紡錘體形，細(xì)胞質(zhì)無顆粒且細(xì)胞數(shù)量在培養(yǎng)2-3天后會倍增。
應(yīng)用[4][5]
用于塞來昔布對人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞放射后凋亡及釋放6-酮—前列腺素F1α、血栓素B2影響研究
塞來昔布對人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞放射后凋亡影響及其機(jī)制研究目的通過培養(yǎng)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（Human brain microvascular endothelial cells,HBMECs）,觀察塞來昔布對于其放射后細(xì)胞凋亡改變及其機(jī)制。
方法1.CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)確定HBMECs半抑制濃度(IC50),依據(jù)IC50確定合適給藥濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
2. 取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),細(xì)胞分別按空白對照、接受X射線、塞來昔布聯(lián)合X射線分為對照組（Con）、單純照射組（IR）、聯(lián)合組（IR+C）;聯(lián)合組塞來昔布孵育24h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),照射劑量為8 Gy,實(shí)驗(yàn)時間點(diǎn)為照射后6、12、24、48h。
3. 克隆形成實(shí)驗(yàn)測定HBMECs放射敏感性,計算在塞來昔布作用下其克隆形成率,求出D0、Dq、SF2、SER值,并繪制細(xì)胞存活曲線。
4. Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測各組不同時間點(diǎn)HBMECs的凋亡率。
5. 蛋白印跡法（Western blot）檢測Cox-2及P-JNK、Cleaved caspase-3的表達(dá)情況。
結(jié)果1.CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明,在塞來昔布作用24h后,10、30、40、50、100μmol/L藥物濃度下其抑制率分別為:4.52±0.13%、6.31±0.07%、9.01±0.10%、15.26±0.70%、70.65±0.89%,SPSS19.0軟件求得IC50值為81.50±0.75μmol/L,后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用30μmol/L這一亞毒性濃度進(jìn)行。
2. 塞來昔布對HBMECs放射敏感性影響:單純照射組及聯(lián)合組均采用多靶單擊模型:y=1-（1-exp（-k*x））^N,算出D0、Dq、SF2、SER值。結(jié)果表明,在30μmol/L實(shí)驗(yàn)濃度下,未觀察到塞來昔布放射增敏作用（SER=0.96）。
3. 流式細(xì)胞術(shù)檢測塞來昔布對受照后HBMECs凋亡影響結(jié)果示,與對照組相比,單純對照組及聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率隨時間升高,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）;聯(lián)合組與單純照射組相比,各時間點(diǎn)凋亡率降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。
4. Western blot結(jié)果所示,對照組HBMECs的Cleaved caspase-3、P-JNK、Cox-2表達(dá)量極少,單純照射組表達(dá)量明顯增加,且Cleaved caspase-3、Cox-2蛋白表達(dá)量隨時間延長呈進(jìn)行性增加;與單純照射組相比,聯(lián)合組在受照后各時間點(diǎn)上述蛋白表達(dá)均降低。
結(jié)論：人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞受照后凋亡率隨時間推移而增加,用30μmol/L濃度的塞來昔布處理人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞能降低其受照射后的凋亡率,同時能降低Cleaved caspase-3、P-JNK、Cox-2蛋白的表達(dá),說明30μmol/L塞來昔布對人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有放射保護(hù)作用,為塞來昔布通過保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的途徑用于防護(hù)放射性腦損傷提供了初步的理論依據(jù),其機(jī)制可能是與30μmol/L濃度的塞來昔布通過抑制Cox-2的表達(dá)從而影響了Cleaved caspase-3、P-JNK的表達(dá)有關(guān)。
參考文獻(xiàn)
[1]Effects of Ionizing Radiation on Cerebral Vasculature[J].Joshua Lucas,William J.Mack.World Neurosurgery.2014
[2]Prostaglandin E 2 Promotes UV Radiation-Induced Immune Suppression through DNA Hypermethylation[J].Ram Prasad,Santosh K.Katiyar.Neoplasia.2013(7)
[3]Mitigation and Treatment of Radiation-Induced Thoracic Injury With a Cyclooxygenase-2 Inhibitor,Celecoxib[J].Nancy R.Hunter,David Valdecanas,Zhongxing Liao,Luka Milas,Howard D.Thames,Kathy A.Mason.International Journal of Radiation Oncology,Biology,Physics.2012
[4]Psoralidin,a dual inhibitor of COX-2 and 5-LOX,regulates ionizing radiation（IR）-induced pulmonary inflammation[J].Hee Jung Yang,HyeSook Youn,Ki Moon Seong,Young Ju Yun,Wanyeon Kim,Young Ha Kim,Ji Young Lee,Cha Soon Kim,Young-Woo Jin,BuHyun Youn.Biochemical Pharmacology.2011(5)
[5]孫佳星.塞來昔布對人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞放射后凋亡及釋放6-酮—前列腺素F1α、血栓素B2影響[D].蘇州大學(xué),2017.