背景[1-3]
人果糖1,6二磷酸醛縮酶(FDA)ELISA KIT用于測定血清、血漿及相關(guān)液體樣本中人果糖1,6二磷酸醛縮酶(FDA)的活性及含量。
人果糖1,6二磷酸醛縮酶(FDA)ELISA KIT檢測原理：試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被樣本抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的樣本呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
果糖1,6二磷酸醛縮酶(FDA)
樣品收集、處理及保存方法
1.血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2.血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。
3.細胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4.組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。
操作步驟：
1．使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。
2．根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復孔的盡量做復孔。
3．加入稀釋好后的標準品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育45分鐘。
4．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
5．每孔加入100ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
7．每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育5分鐘。避免光照。
8．取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。
9．在450nm波長處測定各孔的OD值。
結(jié)果判斷與分析：
1、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值
2、以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應(yīng)的指標標準品濃度為橫坐標（X），做得相應(yīng)的曲線，樣品的含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應(yīng)的濃度,再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
應(yīng)用[4][5]
用于水楊酸（SA）誘導的黃瓜超敏反應(yīng)相關(guān)基因的篩選和表達分析研究
研究試圖通過不同濃度水楊酸來處理黃瓜葉片,在相同環(huán)境的條件下,選出SA處理黃瓜葉片發(fā)生超敏反應(yīng)的最適宜濃度（10mM）,并以該濃度SA處理黃瓜葉片進行了如下實驗:1.黃瓜PCD的鑒定:以四真葉齡的黃瓜幼苗作為實驗材料,葉片上滴加10mM水楊酸（SA）進行誘導處理,采用ROS原位檢測、Trypan blue染色、PI和FDA熒光染色及TUNEL（顯色法和熒光法）檢測,確定10mM SA誘導黃瓜發(fā)生了細胞程序性死亡（PCD）,并伴隨著ROS的積累和H2O2產(chǎn)生;以四真葉齡的黃瓜幼苗作為實驗材料,取葉片表皮細胞經(jīng)0.2%MeJA處理后,采用TUNEL熒光法檢測,確定0.2%MeJA可以誘導黃瓜葉片PCD。
2. SA誘導黃瓜差異表達基因的篩選:葉綠體是發(fā)生植物光合作用的重要細胞器,在植物防御反應(yīng)和超敏反應(yīng)（HR）進程中也起重要作用。因此,通過對1759個高通量測序技術(shù)獲取的差異表達基因的注釋和分析,篩選葉綠體中與超敏反應(yīng)相關(guān)的基因49個,設(shè)計引物。以四真葉齡的黃瓜幼苗作為實驗材料,葉片滴加10mM SA誘導處理,得到總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后,對49個基因進行RT-PCR驗證,得到15個基因。確定這15個基因在發(fā)生PCD的細胞中差異表達。
3. SA誘導黃瓜葉綠體內(nèi)超敏反應(yīng)相關(guān)DEGs的表達分析:通過對15個基因進行半定量RT-PCR表達分析發(fā)現(xiàn),15個基因在SA和MeJA中都表達,呈現(xiàn)相似的表達趨勢,SA與MeJA在誘導黃瓜PCD的過程中可能存在信號交叉,并協(xié)同發(fā)揮作用。
通過實時熒光定量PCR分析葉綠體內(nèi)DEGs的表達趨勢,根據(jù)基因在SA處理下的不同的表達趨勢,可以分為:（1）急劇下降趨勢包括A2（甜菜堿脫氫酶）（2）先下降后上升趨勢D6（原葉綠酸氧化還原酶）、F7（0-琥珀苯甲酸-輔酶A連接酶）、E6（α-葡聚糖-水二激酶1）（3）先上升后下降趨勢:A6（葉綠素還原酶1）、E3（果糖1,6-二磷酸醛縮酶）、E8（丙二烯氧化物環(huán)化酶）、D1（6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶）、G3（胱硫醚β合成酶（CBS）蛋白）、C3（σ因子結(jié)合蛋白1）、A5（脫鎂葉綠酸a單加氧酶）、E7（ATP-依賴鋅金屬蛋白酶）、B3（類囊體加工肽酶）、A4（鈣敏感受體）、E4（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸轉(zhuǎn)運子）。
參考文獻
[1]LESION SIMULATING DISEASE 1 and ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY 1 differentially regulate UV‐C‐induced photooxidative stress signalling and programmed cell death in A rabidopsis thaliana[J].WERONIKA WITUSZY?SKA,MAGDALENA SZECHY?SKA‐HEBDA,MIROS?AW SOBCZAK,ANNA RUSACZONEK,ANNA KOZ?OWSKA‐MAKULSKA,DAMIAN WITO?,STANIS?AW KARPI?SKI.Plant Cell Environ.2015(2)
[2]Possible effects of pathogen inoculation and salicylic acid pre-treatment on the biochemical changes and proline accumulation in green bean[J].Najmeh Ayoubi,Mohammad J.Soleimani.Archives of Phytopathology and Plant Protection.2015(3)
[3]A fructose-1,6-biphosphate aldolase gene from Camellia oleifera:molecular characterization and impact on salt stress tolerance[J].Yanling Zeng,Xiaofeng Tan,Lin Zhang,Hongxu Long,Baoming Wang,Ze Li,Zhen Yuan.Molecular Breeding.2015(1)
[4]RNAi-directed downregulation of betaine aldehyde dehydrogenase 1（OsBADH1）results in decreased stress tolerance and increased oxidative markers without affecting glycine betaine biosynthesis in rice（Oryza sativa）[J].Wei Tang,Jiaqi Sun,Jia Liu,Fangfang Liu,Jun Yan,Xiaojun Gou,Bao-Rong Lu,Yongsheng Liu.Plant Molecular Biology.2014(4-5)
[5]劉雙.水楊酸（SA）誘導的黃瓜超敏反應(yīng)相關(guān)基因的篩選和表達分析[D].哈爾濱師范大學,2016.