背景^[1-3]

前列腺上皮細(xì)胞提取于人正常前列腺組織。原代凍存。每管含有細(xì)胞數(shù)>5×105 cells/ml。此細(xì)胞通過應(yīng)用細(xì)胞角蛋白（CK-14、18和19）抗體進(jìn)行免疫熒光染色驗(yàn)證，經(jīng)測試不含有HIV-1、H、BV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌。細(xì)胞可以達(dá)到15倍增。

前列腺是雄性哺乳動物生殖系統(tǒng)一個重要附屬器官，其結(jié)構(gòu)和功能活動均受雄性激素的調(diào)控。前列腺由具有不同細(xì)胞角蛋白表達(dá)譜的三個帶組成[1]?；准?xì)胞主要表達(dá)高分子量細(xì)胞角蛋白（CK5和CK14），腔分泌細(xì)胞主要表達(dá)低分子量細(xì)胞角蛋白（CK8和CK18），而中間細(xì)胞則同時表達(dá)基底和管腔細(xì)胞角蛋白[2]。越來越多的證據(jù)表明，基底上皮細(xì)胞可分化成管腔上皮細(xì)胞。前列腺癌是影響老年男性的最常見癌癥之一，而且是老年男性一個重要原因死亡。前列腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)為研究前列腺的許多重要特性以及化學(xué)和激素性致癌作用提供了獨(dú)特的機(jī)會。

前列腺上皮細(xì)胞

細(xì)胞接收后的處理方法

1）收到細(xì)胞后，請檢查發(fā)貨培養(yǎng)瓶的狀況，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染。

2）在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞生長狀態(tài)時，在低倍鏡（4或5X物鏡)下進(jìn)行，能準(zhǔn)確判斷細(xì)胞的傳代密度。看細(xì)胞的形態(tài)請?jiān)?0X和20×物鏡下，同時給細(xì)胞拍照各2-3張（10×，20×都要拍照），作為售后的依據(jù)。

3）觀察好細(xì)胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h。

細(xì)胞培養(yǎng)步驟

1、培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備DMEM培養(yǎng)基；馬血清，10%；雙抗，1%。

2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2、細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入250px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。

1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3、按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4、將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

應(yīng)用^[4][5]

用于前列腺上皮細(xì)胞及其表達(dá)CKIP-1對前列腺部尿道創(chuàng)面中成纖維細(xì)胞TGF-β1和α-SMA表達(dá)的影響研究

建立犬前列腺及膀胱頸切除動物模型,觀察兩創(chuàng)面修復(fù)過程及修復(fù)后期創(chuàng)面轉(zhuǎn)化生長因子β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）、酪蛋白激酶2相互作用蛋白1（Casein kinase 2 interaction protein 1,CKIP-1）表達(dá);構(gòu)建過表達(dá)CKIP-1的人前列腺上皮細(xì)胞（BPH-1細(xì)胞）,建立BPH-1細(xì)胞（或過表達(dá)CKIP-1的BPH-1細(xì)胞）與人成纖維細(xì)胞（HFF-1細(xì)胞）共培養(yǎng)細(xì)胞模型,觀察過表達(dá)CKIP-1的BPH-1細(xì)胞TGF-β1表達(dá),共培養(yǎng)下HFF-1細(xì)胞TGF-β1、α-平滑肌肌動蛋白（α-Smooth muscle acting,α-SMA）表達(dá)變化,以期為創(chuàng)面減少瘢痕愈合提供新的數(shù)據(jù)。

方法:（1）建立兩微米（Two micron,2μm）激光犬前列腺及膀胱頸切除動物模型,分別于術(shù)后3天、1、2、3、4、8及12周留取前列腺部尿道及膀胱頸創(chuàng)面標(biāo)本,序貫取材、蘇木素-伊紅（Hematoxylin-eosin,HE）染色光鏡下觀察兩創(chuàng)面修復(fù)病理組織學(xué)變化,免疫組化染色方法檢測術(shù)后3、4、8及12周兩創(chuàng)面TGF-β1、CKIP-1表達(dá);

（2）構(gòu)建過表達(dá)CKIP-1的BPH-1細(xì)胞,Western blot方法檢測BPH-1細(xì)胞TGF-β1表達(dá);分別建立BPH-1細(xì)胞與HFF-1細(xì)胞共培養(yǎng)（共培養(yǎng)組）、過表達(dá)CKIP-1的BPH-1細(xì)胞與HFF-1細(xì)胞共培養(yǎng)（過表達(dá)共培養(yǎng)組）細(xì)胞模型,培養(yǎng)72小時后,Western blot方法檢測各組HFF-1細(xì)胞TGF-β1、α-SMA表達(dá)。

結(jié)果:（1）前列腺部尿道創(chuàng)面由創(chuàng)面下前列腺導(dǎo)管或腺泡內(nèi)基底細(xì)胞增殖、遷移、發(fā)芽后覆蓋創(chuàng)面后再分化完成再上皮化,修復(fù)完成后,創(chuàng)面內(nèi)存在大量前列腺上皮,少量瘢痕形成;膀胱頸創(chuàng)面由創(chuàng)緣旁尿路上皮增殖、遷移并覆蓋創(chuàng)面再分化完成再上皮化,修復(fù)完成后,創(chuàng)面內(nèi)無上皮細(xì)胞,創(chuàng)面見較多瘢痕組織;

（3）前列腺部尿道創(chuàng)面,與術(shù)后3周相比,術(shù)后4、8及12周創(chuàng)面內(nèi)前列腺上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞（或纖維細(xì)胞）TGF-β1表達(dá)均降低（P＜0.01,P＜0.05）;與術(shù)后3周相比,術(shù)后4、8及12周創(chuàng)面內(nèi)前列腺上皮細(xì)胞CKIP-1表達(dá)增加（P＜0.01）;膀胱頸創(chuàng)面,與術(shù)后3周相比,術(shù)后4、8及12周創(chuàng)面內(nèi)成纖維細(xì)胞（或纖維細(xì)胞）TGF-β1表達(dá)無明顯變化;術(shù)后4、8及12周,前列腺部尿道創(chuàng)面內(nèi)成纖維細(xì)胞（或纖維細(xì)胞）TGF-β1表達(dá)較膀胱頸創(chuàng)面內(nèi)成纖維細(xì)胞（或纖維細(xì)胞）TGF-β1表達(dá)降低（P＜0.01）;前列腺部尿道與膀胱頸創(chuàng)面內(nèi)成纖維細(xì)胞（或纖維細(xì)胞）均微弱CKIP-1表達(dá)且術(shù)后3、4、8及12周均無明顯改變;

（3）與對照組相比,過表達(dá)CKIP-1的BPH-1細(xì)胞組TGF-β1表達(dá)降低了25%（P＜0.05）;與對照組相比,共培養(yǎng)組HFF-1細(xì)胞TGF-β1、α-SMA表達(dá)分別降低了20%和30%（P＜0.05）,與共培養(yǎng)組相比,過表達(dá)共培養(yǎng)組HFF-1細(xì)胞TGF-β1、α-SMA表達(dá)分別降低了15%和10%（P＜0.05）。

結(jié)論:（1）前列腺部尿道創(chuàng)面內(nèi)大量的前列腺上皮細(xì)胞可能是該創(chuàng)面少瘢痕愈合的原因之一;

（2）前列腺部尿道修復(fù)后期創(chuàng)面內(nèi)前列腺上皮細(xì)胞可能通過上調(diào)CKIP-1表達(dá)降低了自身TGF-β1表達(dá)并抑制周圍成纖維細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)及向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,減少纖維細(xì)胞的過度增生及瘢痕的過度形成。

參考文獻(xiàn)

[1]Silencing of CKIP-1 promotes tumor proliferation and cell adhesion-mediateddrug resistance via regulating AKT activity in non-Hodgkin’s lymphoma[J].Xinhua Zhu,Yu Ouyang,Fei Zhong,Qiru Wang,Linlin Ding,Peipei Zhang,Lingling Chen,Hong Liu,Song He.Oncology Reports.2017(1)

[2]Re-epithelialization resulted from prostate basal cells in canine prostatic urethra may represent the ideal healing method after two-micron laser resection of the prostate[J].Ying Cao,Guang-Heng Luo,Lei Luo,Xiu-Shu Yang,Jian-Xin Hu,Hua Shi,Ping Huang,Zhao-Lin Sun,Shu-Jie Xia.Asian Journal of Andrology.2015(5)

[3]Re:Prostatic Inflammation Enhances Basal-to-Luminal Differentiation and Accelerates Initiation of Prostate Cancer with a Basal Cell Origin[J].Anthony Atala.The Journal of Urology.2014

[4]Identification of UHRF1/2 as new N-methylpurine DNA glycosylase-interacting proteins[J].Chao Liang,Xueli Zhang,Shanshan Song,Chunyan Tian,Yuxin Yin,Guichun Xing,Fuchu He,Lingqiang Zhang.Biochemical and Biophysical Research Communicatio.2013(4)

[5]王禮鑫.前列腺上皮細(xì)胞及其表達(dá)CKIP-1對前列腺部尿道創(chuàng)面中成纖維細(xì)胞TGF-β_1和α-SMA表達(dá)的影響[D].貴州醫(yī)科大學(xué),2018.