背景[1-5]
TMB是用于免疫組織化學(xué)染色程序的生色底物，以及用于酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）的可視化試劑。TMB是白色結(jié)晶粉末，在與乙酸乙酯的溶液中形成淡藍(lán)綠色液體。TMB因陽光和熒光燈而退化。TMB可以作為氫供體，通過過氧化物酶如辣根過氧化物酶將過氧化氫還原成水。TMB的氧化顯示3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）氧化成3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺二亞胺得到的二亞胺使溶液呈現(xiàn)藍(lán)色，并且可以在分光光度計上以370和650nm的波長讀取該顏色變化。
通過加入酸或另一種終止試劑可以停止反應(yīng)。使用硫酸使TMB變黃?？梢栽?50nm處讀取顏色。于它是光敏的，TMB應(yīng)避免陽光直射。目前還不知道如果TMB是致癌和證據(jù)是矛盾的：TMB不是通過誘變Ames試驗和不誘導(dǎo)在24單臂研究腫瘤形成的老鼠。根據(jù)該證據(jù)，它已被用作替代致癌化合物，如聯(lián)苯胺和鄰苯二胺。TMB已在逐步取代強(qiáng)致癌物聯(lián)苯胺和其他致癌性的聯(lián)苯胺衍生物，應(yīng)用于臨床化驗、法醫(yī)檢驗、刑事偵破及環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域；尤其是在臨床生化檢驗方面，TMB作為過氧化酶的新底物，在酶免疫分析法（EIA）和酶聯(lián)免疫吸附檢驗法（ELISA）中獲得了廣泛的應(yīng)用。
研究應(yīng)用[6][7][8]
1.用于ELISA測定中TMB顯色體系的優(yōu)化及其穩(wěn)定性研究
通過對間接酶聯(lián)免疫測定中顯色體系的各影響因素的研究,確定了酶聯(lián)免疫測定的顯色體系為二甲基亞砜(DMSO)配制四甲基聯(lián)苯胺(TMB)濃度為0.3 mg/mL的溶液為A液,pH5.5,0.2 mol/L磷酸氫二鈉與0.1 mol/L檸檬酸緩沖液配制過氧化脲素濃度為0.74 mg/mL的溶液為B液,兩者按一定比例混合后使用。試驗結(jié)果表明,此顯色體系在25-40℃內(nèi)進(jìn)行都可得到較為準(zhǔn)確的結(jié)果,且A、B液混合后在室溫下放置4 h仍可使用。A液及B液分別在4℃放置60 d后混合使用仍不影響測定結(jié)果。
2.用于優(yōu)化ELISA檢測中TMB/HRP顯色體系的研究
優(yōu)化TMB/HPR顯色系統(tǒng)的反應(yīng)參數(shù)。方法:首先采用單因素試驗,研究顯色體系中的緩沖溶液pH、TMB濃度、H2O2濃度、反應(yīng)時間和溫度對顯色的影響,在此基礎(chǔ)上,再進(jìn)行5因素4水平的正交試驗。結(jié)果:TMB/HRP體系的工作條件:緩沖液pH為5.0,TMB濃度為2.5mg/ml,H2O2濃度為0.03%(V/V),反應(yīng)溫度為30～50℃,反應(yīng)時間為10min。結(jié)論:優(yōu)化的TMB/HRP反應(yīng)條件,可以滿足一般反應(yīng)的要求,所建立的TMB/HRP體系的優(yōu)化方法也適用于其它ELISA顯色系統(tǒng)的優(yōu)化。
3.3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺-H2O2-辣根過氧化物酶伏安酶聯(lián)免疫分析法測定人血清免疫球蛋白E
建立了一種與TMB-H2O2-HRP聯(lián)用的IgE抗體鑒別脈沖伏定免疫分析法。HRP催化H2O2與TMB氧化產(chǎn)生的酶促反應(yīng)產(chǎn)物在pH4.0磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液中，在0.10V(vs.Ag/AgCl)下表現(xiàn)出靈敏的伏安-ric反應(yīng)。本方法對IgE抗體的檢測限為4.0IU/mL，比傳統(tǒng)的分光光度ELISA法低4倍。
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