背景[1-3]
Liver Parenchymal Cells采用混合酶灌流消化、反復(fù)低速離心制備而來，Liver Parenchymal Cells肝實質(zhì)細胞分離自肝臟組織；肝臟是身體內(nèi)以代謝功能為主的一個器官，并在身體里面起著去氧化、儲存肝糖、分泌性蛋白質(zhì)的合成等作用；肝臟也制造消化系統(tǒng)中之膽汁。肝臟是機體內(nèi)臟里的器官，位于機體中的腹部位置，在右側(cè)橫隔膜之下，位于膽囊之前端且于右邊腎臟的前方，胃的上方。肝臟是機體消化系統(tǒng)中的消化腺，為一紅棕色的V字形器官。
Liver Parenchymal Cells
肝臟是尿素合成的主要器官，又是新陳代謝的重要器官。肝臟在機體位置和形態(tài)結(jié)構(gòu)：肝臟位于右上腹，隱藏在右側(cè)膈下和肋骨深面，大部分肝為肋弓所復(fù)蓋，僅在腹上區(qū)、右肋弓間露出并直接接觸腹前壁，肝上面則與膈及腹前壁相接。肝實質(zhì)細胞是指具有肝功能的單位，是肝臟的基本組成單位之一。肝實質(zhì)細胞與主要病生理變化：急性肝炎、肝硬化、肝膿腫。肝實質(zhì)細胞屬于中高度分化細胞，生長營養(yǎng)需求高，在體外存活時間短；細胞呈圓形或多角形，核大而圓，居中，常染色質(zhì)豐富，部分有雙核或多倍體核。肝臟作為體內(nèi)重要的器官，在整個物質(zhì)代謝過程中具有廣泛而多樣的作用。
Liver Parenchymal Cells培養(yǎng)操作：
1)復(fù)蘇Liver Parenchymal Cells：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2)Liver Parenchymal Cells傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
b、加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察HLF-a細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將Liver Parenchymal Cells懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3)Liver Parenchymal Cells凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例；
a、收集Liver Parenchymal Cells及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。
b、根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
應(yīng)用[4][5]
Liver Parenchymal Cells可以用于肝臟非實質(zhì)細胞照射對殘存肝腫瘤細胞及肝實質(zhì)細胞放射敏感性的影響研究
部分肝臟非實質(zhì)細胞的分離培養(yǎng)及細胞因子芯片檢測
目的：肝臟非實質(zhì)細胞經(jīng)輻射后可釋放多種小分子物質(zhì),對肝實質(zhì)細胞放射敏感性及照射后殘存肝癌細胞產(chǎn)生影響。分離培養(yǎng)肝非實質(zhì)細胞,為后續(xù)實驗研究打下基礎(chǔ)。
方法：通過灌洗,消化SD大鼠肝臟,采用密度梯度方法離心分離獲得肝非實質(zhì)細胞,分離到非實質(zhì)細胞培養(yǎng)后行照射,分別提取上清液(SR和SnonR),行細胞因子芯片檢測。
結(jié)果：成功分離得到肝臟非實質(zhì)細胞,分離所得的非實質(zhì)細胞不表達肝實質(zhì)細胞所表達的白蛋白,上清液細胞因子芯片結(jié)果分析顯示：照射后多種炎癥相關(guān)因子及與轉(zhuǎn)移相關(guān)的因子升高。
結(jié)論：輻射可以誘導(dǎo)肝臟非實質(zhì)細胞釋放多種細胞因子,可能對肝實質(zhì)細胞和照射后殘存腫瘤細胞產(chǎn)生影響。
第二部分肝臟非實質(zhì)細胞放療后上清液對肝癌照射存活后代細胞侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響
目的：觀察肝非實質(zhì)細胞經(jīng)輻射后培養(yǎng)上清液是否對肝癌照射的殘存后代細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力發(fā)生影響,并探討這一作用的可能機制。
材料與方法：大鼠肝非實質(zhì)細胞原代分離培養(yǎng)后,隨機分為照射組及非照射組。照射組細胞經(jīng)X線一次性照射10Gy。48小時后提取照射組培養(yǎng)上清液(SR)及非照射組上清液(SnonR)加入McA-RH7777肝癌細胞,肝癌細胞也經(jīng)X線一次性照射10Gy后反復(fù)傳代8代后,觀察它們的侵襲轉(zhuǎn)移能力變化(RH10Gy-SR,RH10Gy-SnonR以及McA-RH7777)。三組細胞分別采用體外transwell小室鋪基質(zhì)膠的侵襲實驗及Buffalo大鼠原位種植后觀察肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié),來檢測它們的轉(zhuǎn)移能力。
結(jié)果：體外實驗觀察,三組細胞侵襲能力RH10Gy-SR>RH10Gy-SnonR>McA-RH7777。三組種入小室的細胞經(jīng)24小時培養(yǎng)后取出計數(shù),200倍視野下穿出數(shù)目分別為40±4.74個,30.6±3.85個和11.4±3.56個。Buffalo大鼠原位種植4周后觀察肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)分別為28.83±5.38,22.17±4.26,8.3±3.8個。ELISA檢測到與轉(zhuǎn)移相關(guān)的多個因子照射組培養(yǎng)上清液較未照射組上清液增高。結(jié)論輻射誘導(dǎo)增強了肝癌殘存后代腫瘤細胞轉(zhuǎn)移侵襲能力的提高,并且輻射刺激肝非實質(zhì)細胞釋放的物質(zhì)促使癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力進一步增強。照射后與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的細胞因子增高可能是促進侵襲轉(zhuǎn)移能力增強的重要因素。
參考文獻
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[3]Radiation therapy for hepatocellular carcinoma:current status and perspectives from our experience.Wei Jiang;;Zhao-chong Zeng.Oncology Reviews,2009
[4]Regenerative capacity of normal and irradiated liver following partial hepatectomy in rats.Shi-Suo Du;;Zhao-Chong Zeng;;Zhao-You Tang;;Zheng-Yu Zhang;;Liu-Sheng Shi;;Zheng Wu;;Ming Qiang;;Zhong-Shan Liu.International Journal of Radiation Biology,2009
[5]周樂源.肝臟非實質(zhì)細胞照射對殘存肝腫瘤細胞及肝實質(zhì)細胞放射敏感性的影響[D].復(fù)旦大學(xué),2012.