背景^[1-3]

HeLa細(xì)胞系是源自一位美國(guó)黑人婦女海瑞塔?拉克斯（Henrietta Lacks）的宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞系。一位外科醫(yī)生從她的腫瘤上取下組織樣本，并在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行培養(yǎng)，仍被不間斷的培養(yǎng)。

HeLa

不同于其他一般的人類細(xì)胞，此細(xì)胞株不會(huì)衰老致死，并可以無限分裂下去。此細(xì)胞系跟其他癌細(xì)胞系相比，增殖異常迅速。

HeLa細(xì)胞是一種人工培養(yǎng)、具有無限增殖能力的細(xì)胞，自誕生以來到2019年已經(jīng)68年了。在醫(yī)學(xué)界，海拉細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于腫瘤研究、生物實(shí)驗(yàn)或者細(xì)胞培養(yǎng)，已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)研究中非常重要的工具。這種細(xì)胞是現(xiàn)有來自人體的組織培養(yǎng)中最早的分離細(xì)胞，在世界各地的研究室繼續(xù)培養(yǎng)，廣泛應(yīng)用于各種研究。它們?cè)隗w外容易增殖形成上皮性的細(xì)胞排列。染色體數(shù)頻率分布式為78-80，移植于人體皮下則形成腫瘤，在豚鼠的眼前房，大鼠的頰囊以及經(jīng)X射線皮質(zhì)酮處理的小鼠可作異種移植，由此可以認(rèn)為仍保持著癌的性狀。廣泛被用作分析細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)要求、細(xì)胞增殖和各種細(xì)胞化學(xué)的研究材料。易從細(xì)胞群落作無性繁殖系分離，有各種變異系的報(bào)道。對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒、腺病毒等的病毒有敏感性，并顯示有明顯的細(xì)胞變性，在病毒研究方面的利用價(jià)值頗大。

HeLa細(xì)胞系培養(yǎng)操作:

1）復(fù)蘇HeLa細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）HeLa細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗C2C12細(xì)胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察HeLa細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）HeLa細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為類；

1.HeLa細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

2.4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

3.將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4][5]

HeLa可以用于二甲雙胍通過影響肌動(dòng)蛋白骨架重組抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞遷移、侵襲和增殖的研究

二甲雙胍對(duì)He La細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架重組的影響,及其影響增殖、遷移和侵襲的過程中coflin的變化,并探討相關(guān)機(jī)制。

方法:應(yīng)用細(xì)胞增殖及毒性(Cell Counting Kit-8,CCK-8)試劑盒檢測(cè)0、5、10、20 mmol/L二甲雙胍分別處理Hela細(xì)胞12h、24h和48h后細(xì)胞活力的變化;使用二甲雙胍處理He La細(xì)胞并進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell遷移和侵襲、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn),檢測(cè)二甲雙胍對(duì)He La細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響;羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色Hela細(xì)胞的絲狀肌動(dòng)蛋白(Filamentous actin,F-actin),觀測(cè)熒光顯微鏡下F-actin的熒光強(qiáng)度變化;檢測(cè)二甲雙胍處理He La細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)(3h、6h、12h和24h)F-actin熒光強(qiáng)度變化;激光共聚焦顯微鏡觀察二甲雙胍處理He La細(xì)胞后肌動(dòng)蛋白骨架結(jié)構(gòu)應(yīng)力纖維(Stress fiber)的變化;檢測(cè)cofilin及其上游LIMK1、ROCK1和Rho A的基因和蛋白表達(dá)變化。

結(jié)果：CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)顯示:隨著二甲雙胍濃度和處理時(shí)間的增加,He La細(xì)胞活力下降(P<0.05)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,二甲雙胍組12h、24h和48h的遷移率都小于NC組(P>0.05;P<0.01;P<0.05)。Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)顯示,二甲雙胍組遷移或侵襲至小室背面的細(xì)胞數(shù)少于NC組(P<0.05;P<0.01)。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示,相較于二甲雙胍處理組,NC組擁有更多且明顯的結(jié)晶紫染色成藍(lán)紫色的細(xì)胞團(tuán)(P<0.01)。熒光顯微鏡下,5 mmol/L二甲雙胍處理He La細(xì)胞24h后F-actin熒光強(qiáng)度增加;在5 mmol/L二甲雙胍處理He La細(xì)胞3h、6h、12h和24h的四個(gè)時(shí)間點(diǎn),He La細(xì)胞F-actin熒光強(qiáng)度均高于NC組(P<0.01、P<0.01、P<0.05和P<0.01)。激光共聚焦顯微鏡顯示:肌動(dòng)蛋白骨架結(jié)構(gòu)應(yīng)力纖維熒光強(qiáng)度增加、應(yīng)力纖維束之間聚攏變粗、分布在細(xì)胞邊緣且出現(xiàn)新的極化方向;細(xì)胞的最長(zhǎng)徑減短(P<0.05),極性降低。

提示:二甲雙胍引起He La細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架結(jié)構(gòu)和分布的改變。RT-PCR結(jié)果顯示:Rho A、LIMK1和Cofilin1的m RNA表達(dá)增加(P<0.01),ROCK1不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。蛋白免疫印跡顯示:總的AMPK蛋白表達(dá)不變,p-AMPK蛋白表達(dá)增加(P<0.01),二甲雙胍激活A(yù)MPK;總cofilin蛋白表達(dá)不變,p-cofilin增加(P<0.05)。提示:二甲雙胍抑制cofilin蛋白的活性。Rho A、ROCK1和LIMK1蛋白表達(dá)增加(P<0.05、P<0.05和P<0.01)。

結(jié)論:1、二甲雙胍可抑制He La細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。2、二甲雙胍影響He La細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架的重組,并引起肌動(dòng)蛋白骨架結(jié)構(gòu)應(yīng)力纖維的變化。3、cofilin蛋白磷酸化增加可影響He La細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架的重組,進(jìn)而抑制He La細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖。

參考文獻(xiàn)

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[4]Human papillomavirus and cervical cancer..Okunade Kehinde Sharafadeen.Journal of obstetrics and gynaecology:the journal of the Institute of Obstetrics and Gynaecology,2020

[5]陳勇.二甲雙胍通過影響肌動(dòng)蛋白骨架重組抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞遷移、侵襲和增殖的研究[D].貴州醫(yī)科大學(xué),2022.