介紹
重組抑肽酶(RTI16)可以抑制激肽酶和胰蛋白酶，是天然的非特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑[1]。它是由58個氨基酸殘基組成的單鏈堿性蛋白，鏈中有3個二硫鍵相互交聯(lián)。長期以來抑肽酶用于急性胰腺炎的治療，90年代后，重組抑肽酶開始用于心肺胸外科手術[2]，用以保護血小板，減少出血和滲血，以及對有凝血障礙病人的臨床治療。因而抑肽酶的市場規(guī)模迅速擴大，一躍成為重要的生化藥物之一。
圖一 重組抑肽酶
合成
目前市售的重組抑肽酶制劑主要為牛肺等器官的提取物，工藝復雜、成本高，因而探討用基因工程方法生產(chǎn)重組抑肽酶有重要意義。
采用分泌表達體系時，抑肽酶產(chǎn)量普遍偏低，所得產(chǎn)品的活性也較低[3，4]。通過融合表達，有望大大提高重組抑肽酶表達量。為此構建了重組抑肽酶表達質(zhì)粒pGrxA-BPTI，并在融合伙伴和重組抑肽酶之間設計了FXa的識別位點。以包涵體形式表達后通過凝膠過濾純化和復性[5，6]，通過FXa將融合伙伴切除，可得到與天然產(chǎn)物活性相當?shù)牡鞍?，通過表達條件的優(yōu)化，產(chǎn)量較以往的表達系統(tǒng)有明顯提高。
工程菌表達優(yōu)化：接種甘油管菌種于LB/Amp平板上，37 ℃培養(yǎng)20 h，刮取菌落接種至LB/Amp液體培養(yǎng)基5 mL，37 ℃，200 r/min，培養(yǎng)過夜。以5%接種量接入玉米漿培養(yǎng)基100 mL，37 ℃，220 r/min搖床培養(yǎng)，誘導7 h后離心(8 000 r/min，5 min，4 ℃)收集菌體，稱量菌體濕重，15%SDS-PAGE檢測表達情況。
發(fā)酵罐培養(yǎng)：采用德國Biostat 30 L發(fā)酵罐，37 ℃，控制溶氧20%，pH 7.0。用發(fā)酵罐表達融合蛋白,16 L發(fā)酵液共得濕菌體260 g,約16 g/L;表達量約45%,
菌體的破壁及包涵體的獲取：培養(yǎng)結束后收集菌體，1 g菌體加入溶液A(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mmol/L EDTA)10 mL，充分懸浮后，冰浴超聲破碎細胞，工作30 s，間隔10 s，功率400 W，30個循環(huán)。液體轉入離心管，4 ℃，8 000 r/min離心15 min，沉淀即為包涵體粗品。
包涵體溶解液的制備：將包涵體粗品用溶液B(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mmol/L EDTA，1%Triton-X100)洗滌兩次，每次作用0.5 h，離心去上清，得到比較純凈的包涵體。1 g包涵體加入溶液C(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，8 mol/L尿素，1 mmol/L EDTA，5 mmol/L DTT)5 mL，4 ℃下過夜，變性溶解，經(jīng)12 000 r/min離心15 min，收集上清即為包涵體溶解液。得到重組抑肽酶。
參考文獻
[1] Ascenzi P,Bocedi A,Bolognesi M,et al.The bovine basic pancreatictrypsin inhibitor(Kunitz inhibitor):a milestone protein[J].CurrProtein Pept Sci,2003,4(3):231-251.
[2] Sylvie R,Bertil K.Aprotinin[J].Ann Pharmacother,1996,30(4):372-376.
[3] Conni L,Poul E.BPTI and-Nterminal extended analogues generatedby factor Xa cleavage and cathepsin C trimming of a fusion protein inexpressed inE.coli[J].Protein Expr Purif,1991,2(5-6):372-378.
[4] Bjorn N,Cara B.Secretion incompetence of bovine pancreatic trypsininhabitor expression inE.coli[J].J Biol Chem,1995,266(5):2 970.
[5] Gu ZY,Marianne Weidenhaupt.Chromatographic methods for theisolation and refolding of proteins fromE.coliinclusion bodies[J].Protein Expr Purif,2002,25(1):174-179.
[6] 姚佳(Yao J),楊坤(Yang K),楊建波(Yang JB),等.新型重組纖維蛋白原受體拮抗劑的表達、純化及活性研究[J].中國藥科大學學報(J China Pharm Univ),2005,36(2):173-178.