背景[1-3]
大鼠睪丸支持細(xì)胞又稱Sertoli細(xì)胞，是生精細(xì)胞的支架，為其提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)，能合成與分泌雄激素結(jié)合蛋白，為其提供高濃度的雄激素環(huán)境等，還具有構(gòu)成血-睪屏障，形成睪丸內(nèi)微環(huán)境，調(diào)節(jié)精子發(fā)生等功能。
睪丸支持細(xì)胞是存在于雄性睪丸間質(zhì)中的主要細(xì)胞類型，其主要功能是分泌和合成睪丸酮，睪丸酮在刺激精子發(fā)生、精子成熟及性功能的維持等方面具有重要作用。目前，以睪丸支持細(xì)胞為靶向的藥物研究備受關(guān)注。體外培養(yǎng)的睪丸支持細(xì)胞能直接反應(yīng)藥物對該細(xì)胞作用的特點，使分離純化睪丸支持細(xì)胞成為必要的前提條件。
大鼠睪丸支持細(xì)胞
大鼠睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)操作
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。**天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）大鼠睪丸支持細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）大鼠睪丸支持細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為類；
1.細(xì)胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。
2.4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。
3.將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
應(yīng)用[4-5]
大鼠睪丸支持細(xì)胞可以用于妊娠期鎘暴露對父系子代大鼠睪丸支持細(xì)胞的影響及相關(guān)基因DNA甲基化作用的研究
妊娠期鎘暴露對子代大鼠睪丸支持細(xì)胞的影響目的:妊娠期鎘暴露對子代大鼠睪丸支持細(xì)胞的影響。
方法:清潔級SD大鼠250±10g,雌雄1:1或1:2合籠飼養(yǎng),次日清晨檢查陰栓或進(jìn)行陰道涂片檢查,發(fā)現(xiàn)陰栓或涂片發(fā)現(xiàn)精子記為妊娠期第0天,將孕鼠(F0代)隨機(jī)分成4組,氯化鎘(0、0.5、1、2mg/kg/day)灌胃染毒,染毒時間為妊娠天直至分娩(即1-21天)。
F0代孕鼠自然分娩產(chǎn)下F1代雄鼠,常規(guī)喂養(yǎng)至5、21和56天(PND5、PND21、PND56)后,隨機(jī)抽取每組F1代成年雄鼠與外來健康的雌鼠1:2合籠交配產(chǎn)生F2代,F2代雄鼠常規(guī)喂養(yǎng)后以同樣的方式產(chǎn)生F3代成年雄鼠。
收集F1、F2及F3代血清和睪丸,行組織病理學(xué)檢查,經(jīng)H&E染色后進(jìn)行曲細(xì)精管(Seminiferous Tubule,ST)直徑測量及Johnsen評分評價睪丸生長發(fā)育情況;透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu);ELISA方法測定血清中促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone,Gn RH)、卵泡刺激素(Follicle Stimulating Hormone,FSH)激素水平;免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行睪丸組織細(xì)胞FSHR定位及表達(dá)量檢測。
結(jié)果:1、妊娠期鎘暴露對子代大鼠生長發(fā)育和睪丸組織病理學(xué)的影響
1.1基礎(chǔ)數(shù)據(jù)顯示:與對照組相比,F1代大鼠體重僅在PND5時,2mg/kg劑量組體重增加(P<0.05);F2代大鼠體重僅在PND21時,1mg/kg劑量組體重增加(P<0.05)。
1.2 H&E染色顯示:F1代大鼠睪丸僅在PND5時,1mg/kg劑量組睪丸曲細(xì)精管直徑減少(P<0.05);F2代大鼠睪丸僅在PND56時,0.5mg/kg劑量組睪丸曲細(xì)精管直徑減少(P<0.05),在2mg/kg睪丸曲細(xì)精管直徑增加(P<0.05);F3代大鼠睪丸0.5mg/kg曲細(xì)精管直徑增加(P<0.05),其他各個劑量組Johnsen評分增加(P<0.05);光學(xué)顯微鏡下顯示三代各時期睪丸支持細(xì)胞未見異常變化,曲細(xì)精管內(nèi)均可見完好精子發(fā)生。
2、妊娠期鎘暴露對子代睪丸支持細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響透射電鏡顯示在F1代大鼠PND5、PND56睪丸支持細(xì)胞在對照組細(xì)胞膜完整、核膜完整與周圍細(xì)胞聯(lián)系緊密,劑量組觀察到睪丸支持細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)改變,出現(xiàn)明顯空泡化、水腫、壞死,并與周圍細(xì)胞間隙增大。
3、妊娠期鎘暴露對雄性子代血清激素的影響血清激素水平檢測顯示:F1代結(jié)果:Gn RH在PND21,0.5mg/kg水平發(fā)生上升(P<0.05)。FSH在PND5時0.5mg/kg水平上升(P<0.05);在PND21時各個劑量組血清中FSH水平下降(P<0.05)。F2代結(jié)果:FSH在PND5,0.5mg/kg水平上升(P<0.05)。F3代結(jié)果:Gn RH、FSH在F3代未見明顯變化。
4、妊娠期鎘暴露對子代睪丸支持細(xì)胞分泌FSHR蛋白的影響妊娠期鎘暴露后F1代PND56睪丸組織經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后觀察到支持細(xì)胞分布在曲細(xì)精管基底面,未見游離支持細(xì)胞,正常組FSHR分布于基底面,蛋白AOD值為0.5090,劑量組FSHR蛋白同樣分布于曲細(xì)精管基底面,蛋白AOD值為0.4011,與對照組相比,FSHR蛋白AOD值降低(P<0.05)。
參考文獻(xiàn)
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