背景及概述^[1]

超敏ECL發(fā)光液用于Western、Northern和Southern blot分子雜交的化學(xué)發(fā)光檢測，比傳統(tǒng)化學(xué)顯色法靈敏度高，可達(dá)pg水平。原理是采用新型發(fā)光底物（Luminol），其與辣根過氧化物酶反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生很強(qiáng)的發(fā)光信號(hào)，在暗室中對(duì)X-光片感光，以此檢測微量蛋白而獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。?；鰪?qiáng)型ECL發(fā)光液具有靈敏度高，持續(xù)時(shí)間長等特點(diǎn)。

組分

組分            數(shù)量

Super ECL A       25 ml

Super ECL B       25 ml

應(yīng)用^[1]

在Western 印跡分析，核酸雜交以及EMSA 實(shí)驗(yàn)中，HRP 標(biāo)記的二抗或探針與靶分子結(jié)合再與底物反應(yīng)產(chǎn)生可見光。蛋白印跡(western blot)分析是根據(jù)抗原、抗體特異性結(jié)合的原理檢測復(fù)雜樣品中某蛋白的技術(shù)。然而當(dāng)樣品中的蛋白濃度過低，特別是目標(biāo)蛋白為低豐度蛋白時(shí)，采用普通化學(xué)發(fā)光檢測，有時(shí)出現(xiàn)蛋白條帶發(fā)光弱，曝光不夠，而采用超敏ECL發(fā)光液檢測則出現(xiàn)蛋白條帶發(fā)光強(qiáng)，曝光過度，兩者的蛋白條帶顯影圖像均不理想。將超敏化學(xué)發(fā)光液稀釋后再檢測，顯影效果顯著提高，蛋白條帶圖像清晰，可見超敏化學(xué)發(fā)光液稀釋法降低蛋白印跡的發(fā)光強(qiáng)度，提高了蛋白條帶的顯影效果。

儲(chǔ)存

2-8°C，Super ECL A要求避光保存。

操作方法（以Western Blot為例)

1．按每平方厘米膜面積用0.1-0.2 ml配置發(fā)光液：根據(jù)發(fā)光液的需要量，取等體積A液和B液，混勻后避光保存?zhèn)溆?；該發(fā)光液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。

2. 取出膜，平放在干凈的保鮮膜上，膜的正面（蛋白質(zhì)面）朝上，在膜的中央加適量的配置好的發(fā)光液（6×8 cm的膜加2 ml發(fā)光液），溶液向四周迅速擴(kuò)散，覆蓋所有膜面。室溫保溫5分鐘左右，在此過程中請(qǐng)仔細(xì)觀察信號(hào)的出現(xiàn)。注意：如果信號(hào)強(qiáng)，在暗室中能很快看到陽性信號(hào)出現(xiàn)。

3. 待信號(hào)出現(xiàn)且穩(wěn)定后，用鑷子夾起膜，除去多余的發(fā)光液，平放在干凈的保鮮膜上，膜的正面（蛋白質(zhì)面）朝上，在轉(zhuǎn)移膜的上面再覆蓋一層保鮮膜，除去保鮮膜與轉(zhuǎn)移膜之間的空氣泡，請(qǐng)務(wù)必保證保鮮膜是干凈的，不被其他雜物或液體污染。

4. 在暗室中，將膜的正面對(duì)著X-光片，放入暗盒。次曝光時(shí)間在1分鐘左右(有經(jīng)驗(yàn)的操作者可以根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱自行決定)，立即按要求對(duì)X-光片進(jìn)行顯影和定影，確定曝光時(shí)間。曝光時(shí)間從數(shù)秒到數(shù)小時(shí)不等；特別弱的過夜曝光也可。

注意

1.PVDF膜較硝酸纖維膜能更好的結(jié)合蛋白，因此呈現(xiàn)較強(qiáng)的信號(hào)。選高質(zhì)量的PVDF膜；盡可能不用Nylon膜。

2.與抗體結(jié)合以后，要保證膜處于濕潤狀態(tài)，否則會(huì)導(dǎo)致背景較高。

3.沒有信號(hào)的原因：有些抗體不識(shí)別變性抗原，有時(shí)需要考慮電泳過程對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響；樣品中無待測蛋白質(zhì)或含量過低；一抗效價(jià)低，用量少，可適當(dāng)增加一抗的用量；

4.背景過高原因：轉(zhuǎn)移膜封閉不充分；與抗體孵育后洗滌不徹底；膜在處理過程中過干；二抗用量過多等。

5.注意及時(shí)更換顯影液、定影液。

主要參考文獻(xiàn)

[1] 范才文, 唐娟, 羅琴, 等. 超敏化學(xué)發(fā)光液稀釋法降低蛋白印跡的發(fā)光強(qiáng)度[J]. 《 廣西師范大學(xué)學(xué)報(bào)》(自然科學(xué)版), 2018, 35(2): 108-111.