背景[1-3]
人B淋巴母細胞是一種免疫細胞，來源于骨髓的多能干細胞，能夠增殖分化，產(chǎn)生B淋巴細胞。B淋巴細胞在抗原刺激下可分化為漿細胞，漿細胞可合成和分泌抗體（免疫球蛋白），主要執(zhí)行機體的體液免疫（humoralimmunity）。
人B淋巴母細胞是一種白血病細胞，是B淋巴細胞的前體細胞。它們在骨髓中產(chǎn)生，并通過血液和淋巴系統(tǒng)傳播到全身各個部位。人B淋巴母細胞的異常增殖和聚集是導致多種B細胞惡性腫瘤(如急性淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病等)的主要原因之一。
人B淋巴母細胞
人B淋巴母細胞培養(yǎng)操作
1)復蘇人B淋巴母細胞：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2)人B淋巴母細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)人B淋巴母細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例；
a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。
b、根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
應用[4-5]
人B淋巴母細胞可以用于銅離子及模擬太空環(huán)境通過ROS/AMPK信號誘導人B淋巴母細胞凋亡
AMPK是生物體內能量代謝調節(jié)的重要信號分子,也是細胞內多種信號通路的中間分子,在細胞凋亡過程中也是必不可少的。之前的研究發(fā)現(xiàn),Cu2+和模擬太空環(huán)境可以通過ROS誘導細胞凋亡,因此AMPK是否參與此過程是我們關注的重點。
我們的結果顯示：1)Cu2+可引起人B淋巴母細胞內AMPK發(fā)生磷酸化并呈現(xiàn)濃度和時間依賴性,同時也可引起細胞內ROS增加,細胞增殖抑制和細胞凋亡增加。
2) 抗氧化劑NAC可降低由Cu2+引起的AMPK高磷酸化水平和ROS的生成,并緩解因此而造成的細胞增殖抑制。
3) 模擬太空環(huán)境(模擬微重力效應下重離子輻射)也可引起細胞內AMPK磷酸化水平的增加,并呈現(xiàn)輻射劑量和時間依賴性。
4) 模擬太空環(huán)境可造成短期內細胞增殖抑制,抗氧化劑NAC對此有緩解作用,隨著細胞代數(shù)的增加細胞增殖逐漸恢復正常。
5) 模擬太空環(huán)境處理過的細胞恢復正常后再次受到外界氧化脅迫(外源性H2O2處理)時,細胞增殖能力仍然存在差異。
6)通過microRNA測序結果以及對數(shù)據(jù)庫查找分析發(fā)現(xiàn)has-miR-185、has-miR-23b、has-miR-27a、has-miR-642a和has-miR-7704可能參與模擬太空環(huán)境誘導的細胞增殖抑制?？傊?Cu2+和模擬太空環(huán)境可引起人B淋巴母細胞內ROS生成,并誘導細胞內AMPK活化最終導致細胞凋亡。模擬太空環(huán)境引起AMPK的活化可能有部分microRNA參與其中。
參考文獻
[1]FV‐429 Induced Apoptosis Through ROS‐Mediated ERK2 Nuclear Translocation and p53 Activation in Gastric Cancer Cells[J].Yuxin Zhou;;Libin Wei;;Haiwei Zhang;;Qinsheng Dai;;Zhiyu Li;;Boyang Yu;;Qinglong Guo;;Na Lu.J.Cell.Biochem.,2015(8)
[2]Toxicity of copper oxide nanoparticles in lung epithelial cells exposed at the air–liquid interface compared with in vivo assessment[J].Xuefang Jing;;Jae Hong Park;;Thomas M.Peters;;Peter S.Thorne.Toxicology in Vitro,2015
[3]Effects of copper overload in P19 neurons:impairment of glutathione redox homeostasis and crosstalk between caspase and calpain protease systems in ROS-induced apoptosis[J].Maja Jazvin??ak Jembrek;;Josipa Vlaini?;;Vedrana Radovanovi?;;Julija Erhardt;;Nada Or?oli?.BioMetals,2014(6)
[4]AMPK-α1 functions downstream of oxidative stress to mediate neuronal atrophy in Huntington's disease[J].Tz-Chuen Ju;;Hui-Mei Chen;;Yu-Chen Chen;;Ching-Pang Chang;;Chen Chang;;Yijuang Chern.BBA-Molecular Basis of Disease,2014(9)
[5]張二東.銅離子及模擬太空環(huán)境通過ROS/AMPK信號誘導人B淋巴母細胞凋亡[D].蘭州大學,2016.