肌酸激酶（EC2.7.3.2）通常存在于動物的心臟、肌肉以及腦等組織的細胞漿和線粒體中，是一個與細胞內能量運轉、肌肉收縮、ATP再生有直接關系的重要激酶，它可逆地催化肌酸與ATP之間的轉磷?；磻?。在磷酸肌酸合成途徑中起到可逆催化肌酸形成磷酸肌酸的作用，正反應過程中需要ATP提供磷?；?，磷酸肌酸含有高能鍵，具有儲能作用，因此可以補償機體ATP的濃度。

磷酸肌酸，在肌肉或其他可興奮性組織（如腦和神經）中的一種高能磷酸化合物，是高能磷酸基的暫時貯存形式，其可以作為心肌細胞保護劑和能量供給物，用于臨床手術和心肌缺血等輔助性治療，效果好，安全性高，社會需求大。目前在磷酸肌酸的生產技術中，生物酶法合成技術由于其具有無環(huán)境污染，反應條件溫和，反應速度快和專一性強等優(yōu)點，已經成為了磷酸肌酸生產工業(yè)的研究重點。

生產工藝

生物酶法生產磷酸肌酸工藝中，技術的關鍵在于肌酸激酶的使用。目前，用于此酶的生產提取難以規(guī)?；?，酶利用效率低等原因導致磷酸肌酸生產成本過高，因而此技術一直沒有得到產業(yè)化開發(fā)，因此尋找一種催化性能高度優(yōu)化的肌酸激酶尤為重要。

本發(fā)明提出一種改造肌酸激酶的方法，以使此酶更適用于磷酸肌酸工業(yè)生產的需求。它能夠進一步提高酶法生產磷酸肌酸工藝中肌酸激酶的催化能力，進而提高磷酸肌酸生產效率，降低生產成本，從而為酶法生產磷酸肌酸工業(yè)化奠定基礎。

本發(fā)明的技術方案為利用基因工程技術，將兔肌肌酸激酶在基因層面上對一些功能位點進行一系列的突變，以期從中篩選到性能進一步改善的肌酸激酶，如改善酶熱穩(wěn)定性，酶催化能力，耐堿性等，以便適用于磷酸肌酸酶法生產中的條件需求。

利用基因工程手段對肌酸激酶進行突變的詳細過程為：

（1）以兔肌肉型的肌酸激酶（GeneBank:NW_003159633.1，25315-33102）為基礎，對其進行一系列的突變，并人工合成突變肌酸激酶基因序列。其突變位點發(fā)生在PRO66、CYS146、TRP210、GLY268和HIS295其中一個至三個氨基酸殘基上，相應替換為SER、ASN、THR和ALA其中一個至三個氨基酸殘基。

（2）構建含有突變序列的克隆載體，所述克隆載體為pUC19；構建含有突變序列的表達載體，所述表達載體為pET21、pET15或pET28。

（3）轉化大腸桿菌進行克隆和高效表達。所述克隆大腸桿菌為DH5α或Top10，所述表達型大腸桿菌為BL21（DE3）。

（4）將發(fā)酵菌液通過高壓勻漿法等物理手段進行破碎，離心，利用乙醇沉淀法進行純化。此步可去除80%以上的雜蛋白，且所得到的肌酸激酶依然保持高活性，可以滿足酶固定化的需求，且純化的成本亦在可接受的范圍內。

本發(fā)明提供了一種可以應用于肌酸激酶酶法工業(yè)生產的酶催化劑突變改造類型，大大提高了酶催化反應效率，降低了生產成本。這些優(yōu)點都為本發(fā)明改造的肌酸激酶能夠廣泛應用于磷酸肌酸酶法工業(yè)生產中提供了保障。

參考文獻

CN104357420A