背景及概述^[1-2]

成纖維細(xì)胞是疏松結(jié)締組織中最常見(jiàn)而且數(shù)量較多的一種細(xì)胞，位于膠原纖維近旁并依附于其上。此細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)可隨其功能狀態(tài)的不同而改變。在功能活動(dòng)旺盛時(shí)，成纖維細(xì)胞的胞體較大，呈扁平星形，有突起。胞核呈卵圓形，核染色質(zhì)較少，著色淺，核仁明顯。胞質(zhì)較多，弱鹼性，內(nèi)含豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核蛋白體、高爾基復(fù)合體以及微絲和微管等結(jié)構(gòu)，表明此種細(xì)胞具有合成和分泌膠原蛋白、彈性蛋白和多糖蛋白，形成膠原纖維、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維和基質(zhì)的作用。在相對(duì)靜止或功能活動(dòng)不活躍時(shí)的細(xì)胞，稱(chēng)為纖維細(xì)胞。這種細(xì)胞比成纖維細(xì)胞小，輪廓不甚清楚，多呈梭形。胞質(zhì)少，弱嗜酸性，其中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體及其它細(xì)胞器均不發(fā)達(dá)。這表明纖維細(xì)胞是功能活動(dòng)不活躍的細(xì)胞。但在一定條件下，如創(chuàng)傷修復(fù)，結(jié)締組織再生時(shí)，纖維細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為功能活躍的成纖維細(xì)胞，積極參與合成和分泌蛋白質(zhì)，形成纖維和基質(zhì)。簡(jiǎn)便快速分離培養(yǎng)成纖維細(xì)胞對(duì)是否能在體外成功建立模擬腫瘤微環(huán)境具有重要意義。成纖維細(xì)胞是疏松結(jié)締組織的主要細(xì)胞，屬生長(zhǎng)與裂殖迅速的細(xì)胞族群，在適當(dāng)?shù)捏w外培養(yǎng)條件下，能迅速增長(zhǎng)繁殖。同時(shí)，成纖維細(xì)胞不僅能提供完整的遺傳物質(zhì)，而且培養(yǎng)方便，對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)和繁殖都無(wú)影響。有研究以小鼠皮膚作為材料探討一種簡(jiǎn)單有效的小鼠皮膚成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，從形態(tài)學(xué)、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)、Westernblot等方法鑒定成纖維細(xì)胞波形蛋白的表達(dá)情況，為成功建立體外模擬腫瘤微環(huán)境打下基礎(chǔ)。

培養(yǎng)^[2]

1. 小鼠皮膚成纖維細(xì)胞組織塊培養(yǎng)法

1)小鼠成纖維細(xì)胞組織塊培養(yǎng)法在已有文獻(xiàn)基礎(chǔ)上優(yōu)化進(jìn)行。將剛出生的小鼠處死，75%酒精浸泡消毒后，放入生物安全柜內(nèi)進(jìn)行操作。先取其背部皮膚，放入75%酒精中浸泡消毒，以無(wú)Ca2+、Mg2+PBS漂洗皮膚。其次，將皮膚剪成1mm2大小，均勻平貼于無(wú)菌平皿中，加入適量DEME完全培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)24h，使皮膚能夠牢固平貼于平皿上。24h后再加入足量的培養(yǎng)基37℃、5%CO2培養(yǎng)，1周后將組織塊去除，即可見(jiàn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)（在這1周內(nèi)除了中間換1次培養(yǎng)基，盡量勿動(dòng)培養(yǎng)平皿）。此后，每2天換1次培養(yǎng)液，8~10d后可見(jiàn)細(xì)胞鋪滿(mǎn)皿底，消化傳代。

2)成纖維細(xì)胞傳代

當(dāng)去組織塊后的成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)平皿中長(zhǎng)成片可傳代時(shí)，吸去舊培養(yǎng)液，用無(wú)Ca2+、Mg2+PBS漂洗1次，加入0.05%胰蛋白酶，覆蓋皿底細(xì)胞，在室溫下輕輕吹打。將平皿在倒置顯微鏡下觀察，消化5min左右后，發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞變圓時(shí)，立即加入等體積的DEME完全培養(yǎng)基終止胰酶反應(yīng)，用吸管輕輕吹打，吹打結(jié)束后，將細(xì)胞懸液移入離心管，1200r/min離心8min，棄上清液后加入DEME完全培養(yǎng)液，吹散混勻按1∶2濃度傳代，以后每2~3天傳代1次。

3)凍存與復(fù)蘇

①凍存：細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)為細(xì)胞單層時(shí)，吸干培養(yǎng)液，以無(wú)Ca2+、Mg2+PBS漂洗后加入0.05%胰蛋白酶室溫消化，細(xì)胞變圓時(shí)，加DMEM完全培養(yǎng)液終止。將細(xì)胞懸液移入離心管，1200r/min離心8min，棄上清液后將細(xì)胞懸浮于含10%二甲亞砜（DMSO）∶10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中，細(xì)胞密度為1×1065×106/ml。分裝于凍存管中。經(jīng)梯度降溫后凍存于液氮中備用。②復(fù)蘇：自液氮取出細(xì)胞，快速放入37℃水浴，融化后加入5倍左右的DMEM完全培養(yǎng)液，離心（1200r/min）8min，棄上清后，加入DEME完全培養(yǎng)液，使細(xì)胞濃度為1×106/ml，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)液。

4)免疫熒光成纖維細(xì)胞免疫熒光顯微鏡檢測(cè)

波形蛋白表達(dá)方法按公司產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)并按參考文獻(xiàn)進(jìn)行。先以無(wú)Ca2+、Mg2+PBS漂洗細(xì)胞，加入預(yù)冷4%多聚甲醛固定15min并用PBS漂洗2遍；次以預(yù)冷的PBST孵育細(xì)胞30min，無(wú)Ca2+、Mg2+PBS漂洗3遍；繼以預(yù)冷的1%牛血清白蛋白（BSA）封閉細(xì)胞30min，1∶20稀釋兔抗小鼠波形蛋白單抗?jié)窈蟹跤?xì)胞，4℃過(guò)夜后以兔抗小鼠波形蛋白單抗PBS漂洗3遍；再以1∶50稀釋FITC標(biāo)記羊抗兔二抗?jié)窈蟹跤?xì)胞，室溫下避光1.5h；最后以PBS漂洗3遍，DAPI染色細(xì)胞后，熒光顯微鏡觀察拍照。

5)流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞

胞內(nèi)染色按照試劑盒說(shuō)明書(shū)并參考文獻(xiàn)進(jìn)行。收集細(xì)胞，先以CD16/CD32抗體按照1μg/1×106細(xì)胞的用量室溫孵育15min以封閉細(xì)胞表面的Fc受體，冷PBS洗滌2次，每次洗滌后1200r/min離心5min，棄上清；其次，加入100μl的固定液，室溫避光固定細(xì)胞20min，以1.0ml的穿膜緩沖液洗滌2次，每次洗滌后1200r/min離心5min；最后，重懸細(xì)胞于100μl的穿膜緩沖液中，加入相應(yīng)的兔抗小鼠波形蛋白單抗PBS漂洗3遍；再以FITC標(biāo)記羊抗兔二抗熒光抗體，室溫避光染色，經(jīng)1.0ml的穿膜緩沖液洗滌2次，每次洗滌后1200r/min離心5min，以FACSCalibur檢測(cè)胞的表面分子并以CellQuest軟件分析數(shù)據(jù)。

2. 結(jié)果

1)小鼠成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)結(jié)果

原代培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)光鏡觀察，發(fā)現(xiàn)組織塊貼壁3d后就可在組織塊周?chē)吹矫黠@的成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，此時(shí)游離出來(lái)的細(xì)胞呈紡錘形或者不規(guī)則三角形，周?chē)猩倭可掀ぜ?xì)胞，胞核清晰，除貼壁的細(xì)胞團(tuán)外，一般不形成集落，如圖1A所示。培養(yǎng)第5天，組織塊周?chē)写罅康某衫w維細(xì)胞，成纖維細(xì)胞群開(kāi)始向外分裂生長(zhǎng)，此時(shí)細(xì)胞呈典型的長(zhǎng)梭形，如圖1B所示。培養(yǎng)第7天，組織塊中基本不再游離出細(xì)胞，原游離的細(xì)胞呈現(xiàn)群體依賴(lài)性生長(zhǎng)，呈典型的梭形，此時(shí)細(xì)胞可生長(zhǎng)成單層，漩渦狀排列或縱橫交錯(cuò)，貼壁的細(xì)胞團(tuán)呈放射狀生長(zhǎng)，如圖1C所示。去掉組織塊，10d左右由組織塊移出的單層細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底，可消化傳代，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)可離心棄上清后重懸細(xì)胞，以棄去多余的組織碎片，傳代后48~72h，細(xì)胞可鋪滿(mǎn)皿底。細(xì)胞經(jīng)凍存復(fù)蘇后，可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，形態(tài)無(wú)異常，如圖1D所示。

2)小鼠成纖維細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果

原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞以其表達(dá)的波形蛋白行免疫熒光鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：誘導(dǎo)的細(xì)胞均表達(dá)成纖維細(xì)胞特有的波形蛋白，呈綠色熒光，DAPI染料可非特異性地染色細(xì)胞核，呈藍(lán)色。以成纖維細(xì)胞系NTH3T3為陽(yáng)性對(duì)照，3T3細(xì)胞也

表達(dá)波形蛋白，但表達(dá)強(qiáng)度有所降低。

3)小鼠成纖維細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果

小鼠皮膚成纖維細(xì)胞會(huì)特異性地在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)波形蛋白，因而利用兔抗小鼠波形蛋白單抗和FITC標(biāo)記羊抗兔熒光抗體，經(jīng)細(xì)胞胞內(nèi)染色后行流式細(xì)胞術(shù)即可對(duì)分離的小鼠成纖維細(xì)胞表達(dá)波形蛋白情況進(jìn)行定量分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與加FITC標(biāo)記羊抗兔熒光抗體的細(xì)胞比較，分離培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞波形蛋白表達(dá)陽(yáng)性率達(dá)13.33%，作為陽(yáng)性對(duì)照的NIH3T3細(xì)胞波形蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為28.11%。以細(xì)胞平均熒光密度測(cè)定成纖維細(xì)胞波形蛋白的表達(dá)情況，分離的成纖維細(xì)胞平均熒光密度為9.89，而陽(yáng)性細(xì)胞NIH3T3波形蛋白平均熒光密度則為14.16。

相關(guān)研究

有研究觀察抗CD95的錘頭狀核酶對(duì)新生小鼠皮膚成纖維細(xì)胞CD95表達(dá)及其凋亡的影響。方法　采用膠原酶消化法分離新生小鼠皮膚成纖維細(xì)胞，并構(gòu)建了針對(duì)CD95mRNA的錘頭狀核酶，經(jīng)鈉米載體Effectene將其轉(zhuǎn)染至成纖維細(xì)胞。通過(guò)RTPCR、流式細(xì)胞儀檢測(cè)成纖維細(xì)胞上CD95表達(dá):細(xì)胞經(jīng)抗CD95抗體(JO2)作用后，通過(guò)Caspase3活性檢測(cè)試劑盒測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞Caspase3活性的變化:MTT法測(cè)細(xì)胞的增殖:AnnexinⅤ凋亡檢測(cè)試劑盒測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果　新生小鼠皮膚成纖維細(xì)胞上表達(dá)CD95，抗CD95核酶能顯著降低細(xì)胞表面CD95水平:細(xì)胞與抗CD95抗體孵育后，與空白對(duì)照和空載體轉(zhuǎn)染組相比，核酶轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Caspase3活性和凋亡率明顯降低，轉(zhuǎn)染核酶的細(xì)胞增殖活性顯著增強(qiáng)。結(jié)論　抗CD95核酶能顯著降低新生小鼠皮膚成纖維細(xì)胞上CD95表達(dá)，使其免于CD95途徑的凋亡，為提高皮膚移植物存活提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

此外，還有實(shí)驗(yàn)研究林蛙皮活性多肽對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞增殖作用。方法用傳代培養(yǎng)的小鼠皮膚進(jìn)行成纖維細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，分為空白對(duì)照組(正常成纖維細(xì)胞+DEME培養(yǎng)液)和增殖實(shí)驗(yàn)組(正常成纖維細(xì)胞+含林蛙活性肽組分的培養(yǎng)液)，采用MTT法觀察兩組細(xì)胞12、24、36和48h后的生存活性。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生存活性明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論林蛙皮活性多肽對(duì)培養(yǎng)的小鼠皮膚成纖維細(xì)胞具有明顯的增殖作用。

主要參考資料

[1] 運(yùn)動(dòng)解剖學(xué)、運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)大辭典

[2] 新生小鼠皮膚成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定

[3] 錘頭狀核酶調(diào)控CD95介導(dǎo)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞凋亡

[4] 林蛙皮活性多肽對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響