背景及概述[1-2]
櫻花素(櫻花亭）5，7-二羥基-4′-芐氧基黃烷酮，最初是由Asahinab從櫻花樹(shù)皮中分離的黃烷酮類物質(zhì)。日本學(xué)者KodamaO，etal(1989年)從稻瘟菌侵染的水稻葉病斑中分離出SA，視為水稻植保素(phytoalexin：PA)。SA對(duì)稻瘟菌的孢子萌發(fā)(ED50＝15)與菌絲生長(zhǎng)(ED50＝5)均有較強(qiáng)的抑制活性。有報(bào)導(dǎo)人工合成SA或SA衍生物制備醫(yī)藥或農(nóng)藥。櫻花素(櫻花亭）主要存在于楊柳科植物毛白楊、山楊的樹(shù)皮，樺科植物岳樺Betulaermanii的樹(shù)皮，無(wú)患子科植物車桑子Dodonaeaviscose的葉中，為二氫黃酮類化合物。具有抗炎活性，干擾平滑肌細(xì)胞的鈣代謝而使平滑肌松弛，對(duì)小鼠耐藥腫瘤細(xì)胞表達(dá)p-糖蛋白或MＲP1具有有效的調(diào)節(jié)作用，對(duì)哮喘有治療作用，因其較高的抗氧化活性，能有效對(duì)抗黑色素沉積，改善膚色暗沉，起到美白嫩膚的作用，在化妝品市場(chǎng)上備受青睞。目前，櫻花素(櫻花亭）在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)未見(jiàn)銷售，不能進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。為了滿足市場(chǎng)需求，為國(guó)內(nèi)相關(guān)機(jī)構(gòu)和企業(yè)開(kāi)展校準(zhǔn)、分析評(píng)價(jià)、仲裁、產(chǎn)品質(zhì)量控制、實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可、能力驗(yàn)證等工作提供準(zhǔn)確、及時(shí)、可靠、可溯源的技術(shù)保障，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)批準(zhǔn)了櫻花素(櫻花亭）國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制。同時(shí)，作為手性異構(gòu)體的標(biāo)準(zhǔn)樣品示范性研制，得到了質(zhì)檢總局的行業(yè)專項(xiàng)資助。
性質(zhì)[1]
1）物理性質(zhì)：熔點(diǎn)為mp151～153℃(甲醇)。旋光度［α］25D=－2.4°(c0.5，甲醇)。分子式C16H1405，理論值為C，67.13%；H，4.90%；測(cè)定值為C，67.00%；H，5.01%，測(cè)定值與理論值一致。2.2.2UV，IＲUVλmax(甲醇)：288，330nm。IＲ(KBr)解析結(jié)果見(jiàn)表1。
2）HＲESI-MSm/z285.0764［M－H］－，與C16H13O5，的理論值(285.0763)一致。
3）NMＲ測(cè)定了1H-NMＲ，1H-1HCOSY，13CNMＲ，DEPT，HMQC，HMBC等數(shù)據(jù)，與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)一致。
4）ＲD甲醇/甲苯室溫中獲得了0.60mm×0.80mm×0.60mm無(wú)色針狀晶體，經(jīng)X-單晶衍射測(cè)定認(rèn)為，該晶體屬于單斜晶系，空間群為P21/c，晶胞參數(shù)為a=12.8531(12)，b=5.7141(3)，c=18.0355(12)，β=97.333(8)°，V=1313.77(16)3，Z=4，Mr=286.27，μ(MoKα)=0.108mm－1，Dc=1.447g·cm－3，F(xiàn)(000)=600，最終的偏離因子為Ｒ=0.0350，wＲ=0.0859，分子內(nèi)和分子間存在氫鍵，D構(gòu)型與L構(gòu)型通過(guò)分子間較強(qiáng)的π-π作用形成了外消旋。結(jié)構(gòu)鑒定表明櫻花素(櫻花亭）樣品的結(jié)構(gòu)為DL-5，4'-二羥基-7-甲氧基二氫黃酮。
應(yīng)用[3]
過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明，櫻花素(櫻花亭）對(duì)犬腎細(xì)胞(MDCK)的毒性較低，半數(shù)中毒濃度TC50為1709.9mg/L。櫻花素(櫻花亭）對(duì)犬腎細(xì)胞感染H5N1病毒具有較明顯的抑制作用，半數(shù)抑制濃度IC50為10.19，治療指數(shù)TI為(167.8)，明顯高于陽(yáng)性對(duì)照組金剛胺烷的TI(11.02)。表明體外櫻花素(櫻花亭）對(duì)H5N1病毒有明顯抑制作用，且毒性較低。體內(nèi)櫻花素(櫻花亭）對(duì)H5N1感染小鼠的治療結(jié)果表明，櫻花素(櫻花亭）可以延長(zhǎng)H5N1病毒感染小鼠的生命率，特別是高、中劑量組，死亡保護(hù)率顯著高于對(duì)照組；H5N1病毒感染可引起小鼠病毒性肺炎，炎性滲出使小鼠肺重量增加，肺指數(shù)值的大小可表示肺病變的嚴(yán)重程度。實(shí)驗(yàn)中櫻花素(櫻花亭）各劑量組均可不同程度的降低小鼠肺指數(shù)，其中高、中劑量組實(shí)驗(yàn)結(jié)果與對(duì)照組比較差異均有顯著性。表明各劑量組對(duì)小鼠流感肺炎均有抑制作用，其200mg/kg劑量組對(duì)感染小鼠的肺炎抑制率為98.05％，死亡保護(hù)率為86.00％，優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組金剛胺烷；小鼠的死亡保護(hù)率、延長(zhǎng)生命率和平均肺指數(shù)與病毒對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.05)。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，櫻花素(櫻花亭）對(duì)H5N1病毒有明顯的抑制作用，其作用效果高于陽(yáng)性對(duì)照金剛烷胺，毒性低于金剛烷胺。
制備[1，3]
方法1：制備取藥材4.8kg粉碎，乙醚脫脂，甲醇回流提取物以蒸餾水懸浮，石油醚脫脂后以乙酸乙酯萃取，硅膠柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯(5∶1)洗脫，甲醇重結(jié)晶，減壓干燥，即得到高純度的櫻花素(櫻花亭）2332mg。每瓶5mg密封于2mL棕色玻璃瓶中，共400瓶。
方法2：櫻花素(櫻花亭）5，7-二羥基-4′-芐氧基黃烷酮生物全合成方法，其合成步驟順序?yàn)椋?/p>
一、按如下順序建立非親和水稻無(wú)性細(xì)胞系；
(1)通過(guò)接種水稻幼穗和種胚篩選出愈傷組織出愈率高的水稻細(xì)胞系；
(2)篩選出的水稻細(xì)胞系轉(zhuǎn)移到固體繼代培養(yǎng)基增殖繼代，第二輪篩選出優(yōu)質(zhì)無(wú)性細(xì)胞系；
(3)應(yīng)用AA培養(yǎng)基逐漸擴(kuò)大優(yōu)質(zhì)無(wú)性細(xì)胞系液體培養(yǎng)量；
二、按如下順序進(jìn)行細(xì)胞系櫻花素(櫻花亭）誘導(dǎo)合成，
(1)選擇櫻花素(櫻花亭）合成誘導(dǎo)子；
(2)將櫻花素(櫻花亭）合成誘導(dǎo)子投放入步驟二的第(3)步細(xì)胞系液體培養(yǎng)液中誘導(dǎo)合成培養(yǎng)不少于72小時(shí)，得含櫻花素(櫻花亭）細(xì)胞系粗培養(yǎng)液；
三、水稻無(wú)性細(xì)胞系誘導(dǎo)合成櫻花素(櫻花亭）分離純化，
(1)將含櫻花素(櫻花亭）誘導(dǎo)合成細(xì)胞系粗培養(yǎng)液機(jī)械破碎；
(2)加70％甲醇提取，甲醇提取液蒸餾去甲醇，得含櫻花素(櫻花亭）細(xì)胞系培養(yǎng)液提取液；
(3)用乙醇萃取步驟三的第(2)步所得含櫻花素(櫻花亭）細(xì)胞系培養(yǎng)液提取液后，蒸餾去乙醇，濃縮得含誘導(dǎo)合成櫻花素(櫻花亭）細(xì)胞系純化培養(yǎng)液。
主要參考資料
[1] 櫻花素(櫻花亭）標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制
[2] CN200310111564.4櫻花素(櫻花亭）的生物合成及應(yīng)用
[3] CN201310111699.4櫻花素(櫻花亭）及其衍生物用于制備抗H5N1病毒藥物的用途