羧肽酶B是一種外分泌蛋白酶, 屬于金屬羧肽酶A和羧肽酶B (CPA/CPB) 家族, 每分子含有一個Zn原子, 可選擇性水解蛋白或多肽羧基端的精氨酸和賴氨酸。胰臟中羧肽酶A和羧肽酶B的最基本功能是在腸道內分解肽段, 肽段由胰蛋白酶降解蛋白質產生, 羧肽酶A對于芳香族或脂肪類氨基酸殘基有最佳的切割能力, 羧肽酶B優(yōu)先切割堿性氨基酸, 但同時羧肽酶B也能切割一些非堿性的氨基酸殘基，在生物化學基礎研究領域中應用廣泛。

圖1 羧肽酶B的性狀圖

結構特性

羧肽酶B(CPB)在胰腺中以無活性的酶原形式合成, 羧肽酶原B的分子質量為46ku, 由401個氨基酸組成;CPB分子質量為35ku, 由306個氨基酸組成。胰腺羧肽酶原B有兩個結構域:催化結構域和激活部分。激活部分保護著活性部位。位于活性中心的Arg-145和激活部分的Asp-41之間形成鹽橋, 以防底物的C端羧基基團結合到Arg-145上。酶原的Asp-41突變?yōu)锳sn或Ala, 可使酶原具有低的內在酶活性, 說明少量底物結合到底物結合部位, 因此, Asp-41和Asp-145之間的鹽鍵形成有助于保持酶原的無活性狀態(tài)。羧肽酶B在科研中的應用主要基于其切割特性，它可以用于蛋白質和肽的測序, 在醫(yī)學上用于診斷胰腺炎。在重組胰島素的生產中,活性胰島素的產生也要依賴于羧肽酶B的切割。[1]

分離方法

Folk等早在1960年已從豬和牛的胰腺分離和鑒定了羧肽酶B。至今,已得到分離純化和鑒定的羧肽酶B有來源于人胰腺、駱駝、鴕鳥、非洲肺魚、鯉魚、、鯰魚、白蝦、小龍蝦、海星等。

活性測定

該方法基于羧肽酶B可以水解馬脲酰-L-精氨酸生成馬尿酸,而馬尿酸 (hippuric acid) 和馬脲酰-L-精氨酸 (hippuryl-L-arginine) 具有不同的吸收光譜。通常的分析方法如下:試驗當天新鮮配制的0.001mol/L馬脲酰L-精氨酸的鹽溶液, 總測定體系3ml, 254nm處調零。加入的羧肽酶B溶液的體積5~20μl, 立即調節(jié)靈敏旋鈕置光吸收為零, 然后根據所需的時間頻繁記錄增加的吸收值，0.001mol/L的馬尿酸緩沖鹽溶液作為常規(guī)的標準對照。整個分析在室溫進行 (25℃) 。最高達40%的水解反應符合零級反應動力學, 因此, 酶的濃度調整到10min內水解反應不超過30%。100%水解的光吸收值為0.36, 在測定范圍內, 數據顯示底物的水解速率與酶濃度呈明顯的正比關系。蛋白濃度和含量可通過測定獲得, 活力單位定義為在0.001mol/L的底物濃度下每分鐘的底物水解百分數。[1]

金屬離子對羧肽酶B活性的影響

Mn2+, Zn2+, Mg2+, Ca2+都能夠不同程度的提高酶的活力, 幾乎所有來源的羧肽酶B在和Co2+孵育一段時間之后, 活力都大大提高。Cu2+可以部分抑制重組羧肽酶B的活力, 而在Hg2+的存在下, 重組羧肽酶B的活力幾乎全部喪失。一些無機鹽在pH=8.0時對羧肽酶B顯示抑制作用,抑制作用順序為NaI, KSCN, NaBr, MgSO4, NaCl, KCl, 和NaNO3, 其中, NaCl, KCl和Na2SO4在pH=7.2和pH=8.0時的抑制作用相同，0.9mol/L NaCl (1×10-4mol/L 馬尿酰-L-精氨酸) 可降低降解速率50%。[1]

穩(wěn)定性

對于不同來源的羧肽酶B活性研究表明，羧肽酶B的活力在pH8左右時為最大值,偏酸性和偏堿性的條件都會使酶活造成不同程度的損失。當pH≥12時,羧肽酶B的活力完全喪失。重組羧肽酶B在pH5時, 活力接近零, 表明重組CPB的等電點就在pH=5左右。在一定的溫度范圍 (<60℃) 內, 羧肽酶B的活力隨著溫度的升高而上升, 隨后下降。溫度對活力的增效作用在所有來源的CPB中是一個普遍現象。比較來源于豬、海星等的CPB來說, 重組CPB的熱穩(wěn)定性要差一些。[1]

參考文獻

[1] 李素霞,張曉彥,張映新,等.羧肽酶B研究進展[J].藥物生物技術, 2006, 13(4):4.