背景及概述[1][2]
用于細胞培養(yǎng)。保存條件： -20°C，一年有效。產(chǎn)品不含酚紅，0.5g/L 胰酶（1：250）溶于 HBSS 溶液，不含鈣鎂。
制備[2]
0.05% 胰酶溶液：稱取0.1g 胰酶，加入200 mL PBS 冰水浴攪拌30 min，0.22 μm的微孔濾器除菌，分裝，-20℃保存；
應用 [3]
針對目前一些采用哺乳動物細胞來測試卷煙煙氣總粒相物遺傳毒性的方法不夠簡便等特點，按照遺傳毒理學檢測應著重來源于人體組織細胞的原則，而專門開發(fā)的一種采用人支氣管上皮細胞系（BEAS-2B細胞）來進行卷煙煙氣遺傳毒性測試的方法，本方法省略了添加代謝活化體系的處理過程，可以較好的反映卷煙煙氣的體外遺傳毒性，操作簡單，靈敏度高，針對性強，結果可靠。
通過以下技術方案來實現(xiàn)的：一種采用雙核法檢測卷煙主流煙氣總粒相物遺傳毒性的方法，包括以下步驟：先在培養(yǎng)好的BEAS-2B細胞中加入卷煙煙氣總粒相物（TPM）的提取物樣品進行暴露，暴露過的細胞經(jīng)培養(yǎng)和冷甲醇固定，然后用DAPI溶液熒光染色，選擇分布均勻、染色較好的區(qū)域，在熒光顯微鏡下拍照計數(shù)，每個樣品計數(shù)1000個雙核細胞中含微核的細胞數(shù)量，與不加卷煙煙氣總粒相物暴露的對照樣品比較，判斷卷煙煙氣引起細胞微核增加的數(shù)量，進而判斷卷煙煙氣的遺傳毒性的大??；具體步驟如下：
a. 細胞培養(yǎng)及接種：將BEAS-2B細胞接種于細胞培養(yǎng)液中并置于CO2培養(yǎng)箱孵育，當細胞生長達到70%-80%匯合時采用0.05% 胰酶溶液消化細胞并制備細胞懸浮液，將制備好的細胞懸浮液計數(shù)后接種至直徑35mm培養(yǎng)皿中，使每皿的細胞數(shù)量為1.5×105-2.0×105個，添加培養(yǎng)液至總體積為2mL，于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h；
b. 卷煙煙氣總粒相物暴露：按照國標的方法通過吸煙機抽吸卷煙，并制備TPM的二甲基亞砜（DMSO）提取物樣品，去除培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，設四類實驗組：細胞對照組、溶劑對照組、陽性對照組和TPM組，各組內(nèi)每個檢測劑量均設3個平行皿；TPM組根據(jù)細胞半數(shù)致死劑量IC50，取1/2 IC50、1/4 IC50、1/8I C50和1/16 IC50 4個劑量，分別加入不同劑量的TPM樣品，并用DMSO補齊各TPM濃度組使得組內(nèi)培養(yǎng)皿中DMSO的濃度一致；細胞對照組只加細胞培養(yǎng)液；溶劑對照組加入DMSO，加入的DMSO量與TPM組1/2 IC50劑量的體積數(shù)一致；陽性對照組加2 μL環(huán)磷酰胺溶液；各組加入受試物后，同時每皿內(nèi)加入12 μL細胞松弛素B溶液，最后用細胞培養(yǎng)液將每皿內(nèi)溶液體積補足至2 mL，繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；
c. 微核測試：移除培養(yǎng)皿內(nèi)的溶液，用PBS溶液漂洗2遍，棄掉洗液后，用約2 mL甲醇溶液固定10 min，倒置晾干，向培養(yǎng)皿中加入1 μg/mL的DAPI 1.5 mL避光染色10 min，用蒸餾水沖洗3次，黑暗處自然晾干或風干；在熒光顯微鏡下紫外激發(fā)進行觀察，選擇分布均勻，染色良好的區(qū)域，進行拍照及圖像計數(shù)，每個樣品計數(shù)1000個雙核細胞中含微核的數(shù)量；選擇觀察的雙核細胞核質(zhì)應相互分開，微核不與主核重疊，易于分辨；
d. 數(shù)據(jù)處理和分析：將TPM組與溶劑對照組相比，統(tǒng)計分析微核率是否有劑量反應關系并有統(tǒng)計學差異，評價卷煙煙氣的遺傳毒性。
主要參考資料
[1] 0.05%胰酶溶液(不含EDTA)說明書
[2] CN201310013300.9 一種卷煙煙氣總粒相物生物學評價的MTT細胞毒性試驗方法
[3] CN201410059881.4 采用雙核法檢測卷煙主流煙氣總粒相物遺傳毒性的方法