背景[1-3]
豬流行性腹瀉病毒(PEDV)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)適用于檢測豬血清、腦、心肌以及淋巴結(jié)等組織標本或病毒培養(yǎng)液中指標的mRNA，適用于指標感染的輔助診斷。
豬流行性腹/瀉(PED)是由豬流行性腹/瀉病毒(PEDV)引起的以腹/瀉、嘔吐、脫水和對哺乳仔豬高致死亡率為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染病。本病一年四季均可發(fā)生,病豬和隱性感染豬是本病的主要傳染源;病毒通過糞-口途徑或感染母豬的乳汁進行傳播。本病與具有類似臨床癥/狀的豬傳/染/性/胃/腸/炎難以區(qū)分,熒光PCR技術(shù)為這2種病原的鑒別帶來便利。
豬流行性腹瀉病毒(PEDV)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)適用于檢測的腸內(nèi)容物和腸系膜淋巴結(jié)、排泄物等標本中豬流行性腹/瀉病毒RNA,適用于豬流行性腹/瀉病毒感染的輔助診斷。
豬流行性腹瀉病毒(PEDV)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)
適用儀器:
ABI7500、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。
標本采集:
剖檢豬取腸內(nèi)容物和腸系膜淋巴結(jié);待檢活豬,取排泄物,于離心管中。
保存和運輸:
采集或處理好的樣品在2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過24 h;若需長期保存,應(yīng)放置-70℃以下保存,凍融不超過3次。
操作步驟:
1.樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
1.2 RNA提取
2.試劑配制（試劑準備區(qū)）
3.加樣（樣本處理區(qū)）
4.PCR擴增（核酸擴增區(qū)）
5.結(jié)果分析判定
6.質(zhì)控標準
陰性質(zhì)控品：無明顯擴增曲線或無Ct值顯示；
陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且Ct值≤30；
以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。
7.產(chǎn)品性能指標
陰陽性參考品符合率：5份陽性參考品符合率為100％；10份陰性參考品符合率為100％。
最低檢測限：檢測靈敏度可達600copies/uL以下。
精密度：批內(nèi)、批間精密度檢測Ct值的變異系數(shù)（CV）均小于等于5%。
應(yīng)用[4][5]
豬流行性腹瀉病毒(PEDV)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)可以用于PEDV RT-qPCR檢測方法的建立和應(yīng)用及CHCQ-2023毒株的分離鑒定
豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是引發(fā)豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea,PED）的病原體,引起仔豬劇烈腹瀉、嘔吐、脫水,病死率高達100%,給養(yǎng)豬業(yè)造成極大經(jīng)濟損失。目前PEDV仍在豬群中廣泛流行,由于病毒基因組的變異率極高,給PEDV的預(yù)防和監(jiān)測帶來一定挑戰(zhàn)。
基于PEDV N基因及豬流行性腹瀉病毒(PEDV)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法),本研究建立一種RT-qPCR檢測方法,并用于檢測臨床樣品,了解川渝地區(qū)近兩年P(guān)EDV流行情況。取陽性病料組織進行病毒分離,獲得一株P(guān)EDV毒株并命名為CHCQ-2023。并通過體內(nèi)外試驗了解該毒株的增殖和致病情況,通過生物信息學(xué)分析了解CHCQ-2023株遺傳突變情況,為預(yù)防和診斷PEDV提供參考。
主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:1.PEDV RT-qPCR檢測方法的建立為建立一種能準確檢測PEDV的RT-qPCR方法,首先將NCBI中所有PEDV N基因序列進行比對篩選獲得保守片段,針對保守片段設(shè)計配對獲得9對引物,通過特異性試驗篩選出特異性最佳的一對引物組合F4/R5。經(jīng)反應(yīng)程序優(yōu)化后構(gòu)建標準曲線,方程:y=-3.3221x+44.687,相關(guān)系數(shù)R2=0.9993>0.99,擴增效率為99.9%,表明本研究建立的RT-qPCR檢測方法特異性好、擴增效率高、具有較好的線性關(guān)系。為進一步檢測本研究建立的RT-qPCR方法的可行性,通過敏感性試驗和重復(fù)性試驗發(fā)現(xiàn),該方法最低檢測濃度為2.4×10～1copies/μL,組內(nèi)變異系數(shù)不超過0.2%、組間變異系數(shù)不超過2%。為了檢驗該方法的實際應(yīng)用效果,采用豬流行性腹瀉病毒(PEDV)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)與本研究建立的RT-qPCR方法同時檢測147份臨床腹瀉樣品。結(jié)果顯示,本研究建立的RT-qPCR方法檢出27份陽性樣本,常規(guī)RT-PCR檢出22份陽性樣本,總符合率為96.59%（142/147）。說明本研究建立的RT-qPCR方法具有良好敏感性、重復(fù)性和準確性。
參考文獻
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[3]The Glycosylation Sites in RBD of Spike Protein Attenuate the Immunogenicity of PEDV AH2012/12.[J].Gege Zhang;Qi Peng;Shiyu Liu;Baochao Fan;Chuanhong Wang;Xu Song;Qiuxia Cao;Chengcheng Li;Hong Xu;Hongting Lu;Meiying Bao;Shanshan Yang;Yunchuan Li;Jiaxiang Wang;Bin Li.Virus research.2024
[4]Angiotensin converting enzyme 2 does not facilitate porcine epidemic diarrhea virus entry into porcine intestinal epithelial cells and inhibits it-induced inflammatory injury by promoting STAT1 phosphorylation[J].Li Zhiqiang;Chen Xueqing;Ma Chang;Du Xinyu;Zhang Yuanshu.Virus Research.2024
[5]胡霞.PEDV RT-qPCR檢測方法的建立和應(yīng)用及CHCQ-2023毒株的分離鑒定[D].西南大學(xué),2024.