技術(shù)背景 

別蘇氨酸是非蛋白質(zhì)氨基酸，是許多具有生物活性多肽的組成部分。D-別蘇氨酸常被用做化學(xué)合成針對(duì)格蘭仕陽(yáng)性菌和陰性菌噻烯酶素抗生素的重要中間體；此外，D-別蘇氨酸還是有效抗HIV環(huán)形縮肽callipeltins和有效抗菌活性脂肽制磷脂菌素的重要組成部分，具有較為廣泛的應(yīng)用。這里簡(jiǎn)單介紹D-別蘇氨酸的合成方法。 

D-別蘇氨酸合成方法 

南京大學(xué)的陸陽(yáng)在其碩士論文《雙酶級(jí)聯(lián)生物合成D-氨基酸研究》中采用了如下方法來(lái)合成制備D-別蘇氨酸[1]： 

1）培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法：LB液體培養(yǎng)基為（g/L）：酵母粉5、蛋白胨10、氯化鈉10，pH 7.0；LB固體培養(yǎng)基需添加2%的瓊脂粉；基因工程菌在培養(yǎng)前加終濃度100μg/mL的氨芐青霉素。大腸桿菌的活化是37℃培養(yǎng)箱中平板倒置培養(yǎng)。大腸桿菌種子培養(yǎng)在37℃條件下轉(zhuǎn)速200rpm的旋轉(zhuǎn)式搖床中培養(yǎng)。采用常規(guī)分子克隆技術(shù)，經(jīng)過(guò)提取質(zhì)粒，雙酶切，膠回收，連接，轉(zhuǎn)化等相關(guān)步驟獲得了重組質(zhì)粒pET-Duet-1-AAR和pGEX-KG-AAR，將其分別導(dǎo)入BL21(DE3)，兩基因工程菌分別命名為D-AAR和K-AAR。 

2）雙酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)制備D-別蘇氨酸：在100mL 0.2M磷酸鉀緩沖溶液中（pH為8.0），加入1g K-AAR全細(xì)胞，4mM磷酸吡哆醛（PLP），5g L-蘇氨酸，40℃、170r/min振蕩反應(yīng)。消旋反應(yīng)結(jié)束后，離心除去K-AAR菌體，上清液煮沸滅活殘留的K-AAR，冷卻至40℃，再加入1g蘇氨酸脫氨酶全細(xì)胞，40℃振蕩反應(yīng)。結(jié)束后得到轉(zhuǎn)化液。 

3）轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分離：將轉(zhuǎn)化完成的轉(zhuǎn)化液高速離心去除菌泥和其它物質(zhì)，80℃加熱，加活性炭脫色，過(guò)濾，用6N HCl調(diào)節(jié)pH至6.0左右，析出D-別蘇氨酸，不斷用母液過(guò)濾，用蒸餾水洗滌D-別蘇氨酸，烘干，得到D-別蘇氨酸9.39g。 

參考文獻(xiàn)

[1]陸陽(yáng). 雙酶級(jí)聯(lián)生物合成D-氨基酸研究[D]. 南京大學(xué)碩士學(xué)位論文. 2016.5.20.