背景技術(shù)

甜味劑是一類廣泛應(yīng)用于食品、飲料及糖果生產(chǎn)的食品添加劑,其既可以在食品的生產(chǎn)過程中添加,也可以在家庭烘焙時經(jīng)過適當稀釋作為蔗糖的替代品使用。甜味劑包括天然甜味劑和人工甜味劑,前者如蔗糖、高果糖玉米糖漿、蜜糖等,后者如阿斯巴甜、糖精等。甜菊糖是一類從植物甜菊中提取出來的天然甜味劑,目前已被廣泛用在食品及飲料中。甜菊的提取物中含有包含瑞鮑迪甙在內(nèi)的多種甜菊糖,天然提取的甜菊糖不同的批次成分差異較大,需要后續(xù)的提純。目前商業(yè)化的產(chǎn)品瑞鮑迪甙A包含一些其它的甜菊糖如瑞鮑迪甙C,D及F等。提取的方法制備的甜菊糖通常還有混有一些雜質(zhì),有可能對其使用范圍造成一定的影響。瑞鮑迪甙M相較于瑞鮑迪甙A具有優(yōu)勢,但其在甜菊葉中的含量極少,且只在甜菊Morite植株中被檢測到 (2010,J. Appl.Glycosci.,57, 199-209)。目前尚未有瑞鮑迪甙M的商業(yè)化生產(chǎn)。

中國專利文獻CN1033970641公開了一種酶法制備瑞鮑迪甙M的方法,該方法利用大腸桿菌制備的UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶或含有UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的大腸桿菌,在葡萄糖基供體存在的情況下,催化瑞鮑迪甙A或瑞鮑迪甙D生成瑞鮑迪甙M。上述方法中,所利用的生產(chǎn)UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因工程菌-大腸桿菌并不是安全的菌株(GRAS,generalregarded as safe),其在培養(yǎng)過程中會產(chǎn)生毒素，生產(chǎn)的瑞鮑迪甙M不能直接應(yīng)用,并且大腸桿菌為原核生物，UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因來自于真核生物,因為真核生物和原核生物的蛋白表達過程的復(fù)雜程度不同,用原核細菌表達真核來源的酶,會影響酶的活性。釀酒酵母是公認安全的菌株,但是在酵母菌中表達外源基因的表達量較低。

制備方法^[1]

利用含有UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的重組釀酒酵母或其制備的UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶,在葡萄糖基供體存在的情況下,催化瑞鮑迪甙A或瑞鮑迪甙D生成瑞鮑迪甙M,所述重組釀酒酵母通過以下方法構(gòu)建：在質(zhì)粒中引入強啟動子得到載體質(zhì)粒,將UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因通過酶切位點插入到所述載體質(zhì)粒上置于所述強啟動子控制之下得到表達載體，然后轉(zhuǎn)化釀酒酵母,得到重組釀酒酵母。

以瑞鮑迪甙D為底物酶法合成瑞鮑迪甙M：在反應(yīng)體系中依次加入100mL 0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.0),0.224g UDP，34.2g蔗糖,0.2g瑞鮑迪甙D，UGT-A凍干粉1g以及SUS凍干粉0.4g，混合均勻后置于37℃水浴，200rpm攪拌反應(yīng)18h。反應(yīng)結(jié)束后,取300u1反應(yīng)液加入600ul 3%甲酸水混勻，10000rpm離心5min取上清液過濾膜后用高效液相色譜檢測(色譜條件:色譜柱:Agilent eclipse sb-C₁₈ 4.6X150mm；檢測波長:210nm；流動相:甲醇:水=68%:32%；流速:1.0mL/min；柱溫:30℃)。瑞鮑迪甙D的轉(zhuǎn)化率為90%以上。經(jīng)樹脂分離、結(jié)晶等后處理純化后得到瑞鮑迪甙M 0.1g,純度大于99%。

參考文獻

[1]蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司,百事可樂公司. 一種利用釀酒酵母酶法制備瑞鮑迪甙M的方法:CN201510375211.8[P]. 2015-12-30.