背景及概述[1]
蛋白質(zhì)僅僅用20種天然氨基酸執(zhí)行了一系列顯著功能，僅有的20種天然氨基酸攜有的功能基團數(shù)量有限，無法滿足化學、生物科學研究和應(yīng)用中對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的需求。目前，通過化學修飾、基因定點突變和計算機輔助蛋白質(zhì)設(shè)計，雖然對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改造賦予了天然蛋白質(zhì)新的功能，但這些方法都依賴于20種天然氨基酸本身；其用于修飾改造的功能基團僅有巰基、羥基、羧基、氨基等幾種有限基團，功能化方式十分有限。與此相反，可人為賦予多樣性功能基團的非天然氨基酸(UnnaturalAminoAcids)在蛋白質(zhì)修飾中表現(xiàn)突出，這些非天然氨基酸含有酮基、醛基、疊氮、炔基、烯基、酰胺基、硝基、磷酸根、磺酸根等多樣性功能基團，可進行多種修飾反應(yīng)，如：點擊化學、光化學、糖基化、熒光顯色等反應(yīng)。通過非天然氨基酸對蛋白質(zhì)進行修飾給其結(jié)構(gòu)和功能的理論研究與應(yīng)用帶來了新的契機。
種類[1]
一系列非天然氨基酸已經(jīng)被用在細菌、酵母和哺乳動物細胞中進行蛋白質(zhì)修飾，其精確性和效率非常高；它們大多都是20種天然氨基酸的衍生物，現(xiàn)今報道的UAA衍生物有苯丙氨酸衍生物、酪氨酸衍生物、谷氨酰胺衍生物、丙氨酸衍生物、半胱氨酸衍生物、絲氨酸衍生物、賴氨酸衍生物等。部分非天然氨基酸結(jié)構(gòu)如圖所示。
修飾方法與過程[1]
1. 化學合成法
固相肽合成方法和半合成方法相結(jié)合能合成出含非天然氨基酸的大片段蛋白質(zhì)。例如，在化學連接中，一個C端含一硫脂的多肽將和一個N端含半胱氨酸的多肽反應(yīng)，在經(jīng)歷一個酰基重排后，硫脂鍵形成一個肽鍵將這兩個片段連接在一起。固相肽合成和連接技術(shù)已經(jīng)用于修飾蛋白質(zhì)骨架、紅細胞生成素同系物、熒光探針、信號蛋白、離子通道、組蛋白等。然而這項技術(shù)的應(yīng)用受所需要保護基團的化學性質(zhì)、連接位點、蛋白質(zhì)折疊等限制。
2. 體外生物合成法
體外生物合成方法已經(jīng)合成了含UAA的蛋白質(zhì)。在這個技術(shù)中，縮短了的tRNAs被酶法連接到化學氨?；暮塑账嵘?，這些目的tRNA從連接的天然氨基酸上去耦掉，同時與非天然氨基酸結(jié)合；隨后細胞翻譯系統(tǒng)在相應(yīng)的空白密碼子或者編碼密碼子下，使用這些帶有非天然氨基酸的氨?；膖RNAs合成蛋白質(zhì)，但含有非天然氨基酸的氨?；痶RNA加合物穩(wěn)定性很差。
3. 顯微注射法
在體內(nèi)，通過顯微注射技術(shù)對蛋白質(zhì)進行位點特異性修飾來自于體外生物合成方法的拓展。如非洲爪蟾蜍卵母細胞被顯微注射進2種RNA：一種是編碼蛋白質(zhì)的mRNA，其目標位點含有UAG終止密碼子；一種是合成的氨?；^tRNA(suppressortRNA)，它能裝載相應(yīng)的UAA。在體內(nèi)，通過UAG終止密碼子對蛋白質(zhì)進行位點特異性修飾，其中非天然氨基酸有酪氨酸同系物、a一基氨基酸等。但它繼承了體外生物合成方法的缺點，即校正tRNA必須在體外化學氨?；瘞蟄AA，氨?；膖RNA不能被重復(fù)利用，只能應(yīng)用于能進行顯微注射的細胞口。
4. 營養(yǎng)缺陷型法
50年以前，研究者發(fā)現(xiàn)許多天然氨基酸的同系物能抑制細菌的生長，分析發(fā)現(xiàn)在這些氨基酸同系物存在下合成的蛋白質(zhì)，其天然氨基酸已被同系物替換，這是因為氨酰-tRNA合成酶(aminoaeyl-tRNAsynthetase，aaRS)不能明顯地把天然氨基酸和其同系物嚴格區(qū)分開來，例如，正亮氨酸(norleucine)能被甲硫氨酰-tRNA合成酶識別，氟苯丙氨酸(p—fluorophenylalanine)能被苯丙氨酰一tRNA合成酶識別。同時用4(s)一氟脯氨酸，4-氟苯丙氨酸和6～氟色氨酸(3種非天然氨基酸對脂肪酶進行修飾，其脂肪酶的結(jié)構(gòu)和活性均未被破壞。DNA聚合酶是一種高的動力學酶，用大腸桿菌營養(yǎng)缺陷型菌株對DNA聚合酶中32個脯氨酸替換成4(R)一氟脯氨酸(4(R)一fluoroproline，(4(R)一F)Pro)，完成了(4(R)一F)Pro對DNA聚合酶的修飾，而DNA聚合酶在其保真度、活性和敏感方面均未發(fā)生變化。但運用營養(yǎng)缺陷性菌株來進行非天然氨基酸對蛋白質(zhì)的修飾，沒有位點特異性、細胞不能持續(xù)生長，且非天然氨基酸僅是天然氨基酸的同系物。
5. 翻譯后修飾法
蛋白質(zhì)翻譯后修飾在生命體中具有十分重要的作用，它使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，功能更為完善，調(diào)節(jié)更為精細，作用更為專一。常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程有泛素化、磷酸化、糖基化、脂基化、甲基化和乙?；?。通過在麥芽糖結(jié)合蛋白、人類生長激素和分枝桿菌磺基轉(zhuǎn)移酶蛋白中，引入一個含6個氨基酸的共有序列(LCTPSR)，它能被甲酰甘氨酸生成酶識別并修飾，從而生成醛基基團，新生成的醛基基團能進一步引人生物物理探針和抗原表位標簽到蛋白質(zhì)中。用疊氮基酪氨酸(3-azidoty—rosine)對鈣調(diào)蛋白進行修飾，再用三芳膦同系物對其進行選擇性的生物?；揎棧瑥亩_創(chuàng)了一種新的蛋白質(zhì)位點選擇性翻譯后修飾方法。
應(yīng)用現(xiàn)狀和前景[1]
1. 生物催化
1)提高酶催化活性
在生物技術(shù)領(lǐng)域，酶經(jīng)過化學修飾后能夠在有機溶劑中高效地發(fā)揮催化作用，并表現(xiàn)出新穎的催化性能。現(xiàn)在研究者也引入許多催化基團到蛋白質(zhì)中，細菌磷酸三酯酶PTE)以非?？斓霓D(zhuǎn)化效率催化農(nóng)藥對氧磷水解，其活性已接近進化限制。利用tRNA'cu／TyrRS對，用L一(7-羥基香豆素一4一基)乙基甘氨酸或L一(7一甲基香豆素一4一基)乙基甘氨酸(對PTE進行修飾，其PTE的催化效率提高了8～11倍，這為酶的分子改造提高其活性提供了一條新的思路。
2)增強酶熱穩(wěn)定性
特氟龍能使阻燃和防火氟化高分子材料表面固化，受此啟發(fā)，紐約大學金·蒙克萊爾研究小組開創(chuàng)了一種能增強蛋白質(zhì)界面的工藝過程。借助營養(yǎng)缺陷性菌株和在培養(yǎng)基中加入對氟苯丙氨酸，制備了對氟苯丙氨酸磷酸酯酶，性能測試顯示，這種酶蛋白具有類似于特氟龍的耐熱性能，在60℃的高溫下仍可保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，同時活性和功能沒有絲毫減弱。在同樣溫度下，天然蛋白質(zhì)分子中的氫鍵會斷裂，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)改變并發(fā)生蛋白質(zhì)變性。通過此氟化氨基酸對蛋白質(zhì)的修飾，給蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定研究開辟了新的視野。
2. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能探針
光誘導(dǎo)化學反應(yīng)存在自然界中，它能調(diào)節(jié)許多細胞和生物功能，Wang等。用光反應(yīng)非天然氨基酸對一(2一四唑)苯丙氨酸(p-(2一tetrazole)phenylalanine，(p-Tpa))對肌紅蛋白進行修飾，這給用光來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能提供了可能。對甲氧基苯丙氨酸([C]p—methoxypheny1alanine)對P450進行修飾，修飾后P450和其它原子結(jié)合，可以用來闡明P450在配體位點的構(gòu)象改變，同時也可以解釋哺乳動物P450的復(fù)雜動力學現(xiàn)象。
3. 藥物蛋白
在醫(yī)療蛋白開發(fā)上，大量同源修飾蛋白的產(chǎn)生是理想的_5。如對許多抗原和抗原決定簇來說，一個強烈的免疫反應(yīng)是需要的，利用校正tRNAcLyur／TyrRS對，用對乙酰苯丙氨酸(p-acety|一phenylalanine)對抗體抗原結(jié)合片段進行修飾，這給多聚物醫(yī)療蛋白的產(chǎn)生提供了可能。
4. 蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)
蛋白質(zhì)交聯(lián)在疫苗開發(fā)、藥物傳遞、功能型水合膠方面發(fā)揮著重要作用。這些交聯(lián)雖然發(fā)生在自然中，但實驗室很難應(yīng)用這個方法。通過3，4一二羥一L一苯丙氨酸(3，4-dihydroxy—L-phenylala—nine)對GFP蛋白進行修飾，從而實現(xiàn)了蛋白質(zhì)與多聚糖的生物交聯(lián)，這給蛋白質(zhì)交聯(lián)和合成生物學的發(fā)展帶來了新的希望。用對炔丙基氧苯丙氨酸(p-propargyloxyphenyla1anine，(pPa))完成了二氫葉酸還原酶和超折疊綠色熒光蛋白的修飾，由于pPa含有酮基，它能在一價銅離子介導(dǎo)下使炔基與疊氮基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，同時pPa對UV不敏感，這使異源蛋白質(zhì)間的交聯(lián)也成為了可能。
制備[1]
一種制備非天然氨基酸及其手性拆分的方法，本法以金剛烷甲酸為原料，制備3-羥基金剛烷甲酸，再經(jīng)過氯化、氧化等得到2-(3-羥基-1-金剛烷基)乙醛酸，與鹽酸羥胺反應(yīng)得到3-羥基金剛烷乙醛酸肟，用還原劑還原并用Boc酸酐保護得到N-叔丁氧羰基-3-羥基金剛烷基甘氨酸。再用有機堿拆分得到(S)-N-叔丁氧羰基-3-羥基金剛烷基甘氨酸和(R)-N-叔丁氧羰基-3-羥基金剛烷基甘氨酸兩種非天然氨基酸。本發(fā)明與已有技術(shù)相比，改進了合成工藝，反應(yīng)條件溫和，環(huán)境污染小，適合工業(yè)化生產(chǎn)
主要參考資料
[1] 非天然氨基酸修飾蛋白質(zhì)研究進展
[2] 蛋白質(zhì)功能化新策略：嵌入非天然氨基酸
[3] CN201510133561.3一種制備非天然氨基酸的方法