背景[1-6]
小鼠肝外膽管上皮細(xì)胞分離自肝臟組織；肝臟是身體內(nèi)以代謝功能為主的一個(gè)器官，并在身體里面起著去氧化、儲(chǔ)存肝糖、分泌性蛋白質(zhì)的合成等作用；肝臟也制造消化系統(tǒng)中之膽汁。肝臟是機(jī)體內(nèi)臟里的器官，位于機(jī)體中的腹部位置，在右側(cè)橫隔膜之下，位于膽囊之前端且于右邊腎臟的前方，胃的上方。肝臟是機(jī)體消化系統(tǒng)中的消化腺，為一紅棕色的V字形器官。
肝臟是尿素合成的主要器官，又是新陳代謝的重要器官。肝臟在機(jī)體位置和形態(tài)結(jié)構(gòu)：肝臟位于右上腹，隱藏在右側(cè)膈下和肋骨深面，大部分肝為肋弓所復(fù)蓋，僅在腹上區(qū)、右肋弓間露出并直接接觸腹前壁，肝上面則與膈及腹前壁相接。通過控制激素調(diào)控的分泌和吸收，在保持、調(diào)整和擴(kuò)大膽小管的結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用，肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞在先天性和獲得性免疫應(yīng)答方面起著積極作用。肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞約占肝細(xì)胞總數(shù)的5%，其在肝內(nèi)膽道系統(tǒng)內(nèi)形成復(fù)雜的網(wǎng)狀管形結(jié)構(gòu)。
肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞具有復(fù)雜的生理代謝功能，參與肝臟的代謝、排泌、免疫等生理過程，在肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起一定的作用。研究表明，常見的肝內(nèi)膽管病變例如原發(fā)性硬化性膽管炎、膽管癌等疾病，都是以肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞為病變靶位，進(jìn)而引起肝內(nèi)膽管上皮損傷。因此，了解正常肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的生物學(xué)特征和病變肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的病理特征對(duì)研究肝內(nèi)膽管病變的發(fā)病機(jī)制、診斷和治療具有重要意義。
應(yīng)用[7][8]
小鼠肝外膽管上皮細(xì)胞可用于肝外膽管系統(tǒng)中CD63~+干細(xì)胞的識(shí)別鑒定及其修復(fù)肝臟損傷能力的研究：
肝臟干細(xì)胞是一類具有自我更新能力并可分化為成熟肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的肝臟原始細(xì)胞,它們參與肝臟發(fā)育、生長(zhǎng)和損傷修復(fù)與再生的過程。在前期的研究中,發(fā)現(xiàn)肝干細(xì)胞作為細(xì)胞移植的治療用細(xì)胞與成熟肝細(xì)胞等其它類型細(xì)胞相比至少有以下優(yōu)點(diǎn):1)肝臟干細(xì)胞植入受體后增殖能力強(qiáng)并有重構(gòu)肝干細(xì)胞巢的潛能;2)肝干細(xì)胞可以分化為肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞和其他間質(zhì)細(xì)胞;3)體外對(duì)肝干細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增比成熟肝細(xì)胞相對(duì)容易;4)肝干細(xì)胞為原始未分化狀態(tài)細(xì)胞,相對(duì)于其他細(xì)胞,免疫原性很低。
對(duì)于小鼠肝外膽管系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn):
1)原位免疫組化染色顯示,小鼠肝外膽管系統(tǒng)存在干性細(xì)胞,且這些細(xì)胞共表達(dá)肝干細(xì)胞分子標(biāo)志CK19、EpCAM和Alb,但不表達(dá)間質(zhì)相關(guān)分子標(biāo)志αSMA;我們利用IV型膠原酶和胰酶聯(lián)合處理消化小鼠肝外膽管組織,利用肝干細(xì)胞培養(yǎng)基Scm A可以將這些細(xì)胞在體外進(jìn)行穩(wěn)定擴(kuò)增,且這些細(xì)胞在基因和蛋白水平均表達(dá)EpCAM、CK19、Alb、N-cadherin、Sox9、Pan-CK和E-Cadherin等肝干細(xì)胞分子標(biāo)志,體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)表明這些細(xì)胞能被誘導(dǎo)分化為成熟肝細(xì)胞樣細(xì)胞;
2)鑒于CD63可以作為肝內(nèi)肝干細(xì)胞特異性的分子標(biāo)志,我們首先在原位鑒定了小鼠肝外膽管組織中存在CD63+細(xì)胞,且這些細(xì)胞共表達(dá)肝干細(xì)胞分子標(biāo)志EpCAM、CK19、Alb和Lgr5;繼而通過流式分選將小鼠肝外膽管內(nèi)CD63+細(xì)胞分離純化后,基于前期建立的肝干細(xì)胞培養(yǎng)基條件,通過改良后添加生長(zhǎng)因子:b FGF和VEGF,可以將這些細(xì)胞在體外穩(wěn)定培養(yǎng)和增殖(大于30代);
3)通過抽提RNA和細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),這些小鼠肝外膽管CD63+細(xì)胞在基因水平和蛋白水平表達(dá)CK19、Sox9和EpCAM等肝干細(xì)胞分子標(biāo)志;
4)體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)顯示,小鼠CD63+細(xì)胞可以被誘導(dǎo)為具有合成糖原、吲哚菁綠的攝入和排出及具有LDL受體等成熟肝細(xì)胞的功能和表型,以及能夠形成囊管狀結(jié)構(gòu)(且囊管結(jié)構(gòu)內(nèi)的細(xì)胞具有極性)和運(yùn)輸羅丹明等成熟膽管上皮細(xì)胞的功能;
5)將標(biāo)記了綠色熒光蛋白(GFP)的小鼠CD63+細(xì)胞移植入延胡索酰乙酰乙酸脫氫酶(Fumarylacetoacetate hydrolase,Fah)基因缺陷(Fah-/-)小鼠模型中,發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞不僅可以分化為成熟肝細(xì)胞來再殖入受損的肝臟(再殖效率可高達(dá)19.69%),還可以分化為膽管上皮細(xì)胞(再殖效率可高達(dá)10.85%),這也是首次在Fah-/-小鼠體內(nèi)觀察到有移植的干細(xì)胞可以分化為膽管上皮細(xì)胞。說明小鼠肝外膽管系統(tǒng)中CD63+細(xì)胞確實(shí)是真正的干細(xì)胞,其不僅具有肝干細(xì)胞基本特性,而且具有較好的修復(fù)肝臟損傷的能力。
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