簡介

普魯蘭酶(Pullulanase)是一類淀粉脫支酶，因能專一性降解普魯蘭多糖而得名。普魯蘭酶最初由Bender和Wallenfels在產(chǎn)氣克雷伯菌(Klebsiella aerogenes)中分離獲得，目前多數(shù)使用的普魯蘭酶來源于克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、嗜熱桿菌屬(Thermophilus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)等。普魯蘭酶根據(jù)催化機理和作用位點的不同，可分為I型和II型，I型普魯蘭酶通過內(nèi)切方式將普魯蘭多糖和支鏈寡糖中的α-1,6-糖苷鍵水解為麥芽三糖和線性寡糖。工I型普魯蘭酶是雙功能酶，可以水解底物多糖的α-1,6-糖苷鍵，同時也能內(nèi)切低聚糖的α-1,4-糖苷鍵。

不同微生物來源的普魯蘭酶在保守功能區(qū)域具有共同的特征，包括A、B、C、F結構域以及一個活性中心和底物結合位點。其中，A結構域為8個β-折疊和8個α螺旋構成的(β/α)₈桶狀結構，該區(qū)域含有與活性中心相關的催化三聯(lián)體結構，分別為催化親核試劑(β-4-Asp)、質(zhì)子供體(β-5-Glu)以及過渡態(tài)穩(wěn)定劑(β-7-Asp)。C結構域通過β-反平行片層與A結構域的疏水基團相互作用，以維持A結構域的穩(wěn)定構象。有報道稱共有序列YNWGYDP是大多數(shù)I型普魯蘭酶的典型序列，與酶的催化活性和底物結合作用密切相關。然而，不同來源的普魯蘭酶結構域的氨基酸序列并不高度保守，導致了其酶學性質(zhì)的差異[1]。

酶學性質(zhì)

溫度、pH和金屬離子等會影響酶的活性及其穩(wěn)定性。根據(jù)普魯蘭酶最適溫度的不同，可分為常溫酶(35-60℃)、嗜熱酶(75℃以上)和超嗜熱酶(90℃以上);根據(jù)普魯蘭酶最適pH的不同，可分為嗜酸性酶和嗜堿性酶，對應pH范圍為pH3.0-6.0和pH8.0-11.0。大多數(shù)不同來源的普魯蘭酶最適溫度范圍為40-90℃，最適pH范圍為4.0-7.0。Chen等獲取的KlebsiellaI型普魯蘭醇酶最適溫度為55℃，最適pH為5.0。Abbas Bukhari等篩選到的Geobacillus stearothermophilus I型普魯蘭酶最適pH為7.0，最適溫度為70°C，并在90°C仍保持一定酶活性，可以滿足特定工業(yè)用途。

應用

普魯蘭酶作用于α-1,6-糖苷鍵的特性和內(nèi)在酶學性質(zhì)決定了其在食品工業(yè)、淀粉加工業(yè)等行業(yè)的廣泛應用。普魯蘭多糖是由α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵組成的高分子量線形多糖，普魯蘭酶因特異性水解α-1,6-糖苷鍵，可用于低分子量普魯蘭多糖的獲取和麥芽三糖糖漿的工業(yè)生產(chǎn)?；诖颂匦?，還可以與其他淀粉酶聯(lián)合使用，提高淀粉轉(zhuǎn)化效率，更大程度地獲取葡萄糖、麥芽糖或果糖糖漿。但由于淀粉轉(zhuǎn)化過程中，液化所需條件約為pH6.0和105℃，而后續(xù)糖化條件為pH4.5和60℃左右，因此普魯蘭酶需要具備一定的耐熱性和耐酸性。普魯蘭酶也被用于水解淀粉中的α-1,6-糖苷鍵制備高直鏈淀粉，以獲取具有更高營養(yǎng)價值的“抗性淀粉"。Krishnan等以水稻為模型作物，研究了普魯蘭酶在抗性淀粉形成中的新作用，并定性和定量分析驗證了普魯蘭酶活性在不同發(fā)育階段與抗性淀粉含量產(chǎn)生的相關性。

除此之外，普魯蘭酶也可在烘焙工業(yè)中用作保鮮劑，以改善烘焙產(chǎn)品的質(zhì)地、體積和風味。普魯蘭酶也用作牙菌斑控制劑。一些堿性普魯蘭酶已被用作洗碗劑或作為洗衣液中的添加劑，用于在堿性條件下去除油脂和污漬。

研究現(xiàn)狀

迄今為止，普魯蘭酶已從多種微生物中獲取并得到廣泛應用。用于工業(yè)生產(chǎn)時，普魯蘭酶需要在特定溫度和pH條件下參與底物轉(zhuǎn)化反應，但大多數(shù)普魯蘭酶存在穩(wěn)定性差、催化效率低以及應用性能不佳等問題，常通過補加酶以保證反應正常進行，酶的過度添加或添加不足均會造成資源浪費，并且傳統(tǒng)方法在實時快速測定酶活性方面存在一定的制約性，不利于精準控制反應過程，可能會導致反應過程的不穩(wěn)定，影響終產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量。

由此可見，目前普魯蘭酶主要存在兩大問題。首先，普魯蘭酶作為一種蛋白質(zhì)，易受高溫、強酸或強堿等外界因素的影響，導致酶變性失活并產(chǎn)生沉淀，影響催化效率。為解決此問題，一些研究者通過尋找表達耐高溫或耐酸堿普魯蘭酶的新菌株以提高酶的穩(wěn)定性，但這種方式效率低且具有盲目性，并且天然菌株表達量較低。目前，更多的研究者致力于通過掌握蛋白酶分子的結構或序列信息，采用定點誘變或結構域修飾等方法來提高普魯蘭酶的穩(wěn)定性及其活性，例如借助蛋白質(zhì)工程技術基于酶蛋白的序列對現(xiàn)有普魯蘭酶進行改造的策略。Wang等利用生物信息學分析手段預測了B.naganoensis來源的普魯蘭酶二級結構，并通過降低二級結構的無序性發(fā)現(xiàn)可以有效提高普魯蘭酶的活性。蛋白質(zhì)本身結構的聚集或展開是引起酶活性變化的根本原因，深入了解蛋白質(zhì)結構與酶活性之間的關系，對于利用分子改遺以優(yōu)化普魯蘭酶穩(wěn)定性具有非常重要的意義。

其次，傳統(tǒng)酶活性測量方法需要依賴于與某種底物系統(tǒng)特異性結合，通過底物耗盡或產(chǎn)物形成，間接測量酶的活性，具有操作復雜、耗時以及測量具有不連續(xù)性等缺點。目前常用測定普魯蘭酶活性的方法是3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS法)，但在使用此方法時，需要考慮底物終濃度、DNS試劑與酶反應液的體積比以及反應時間等因素，并且需要仔細取樣和準確控制溫度以順利進行顯色反應。目前，許多研究者致力于改良現(xiàn)有的顯色法或者研究新的酶活性測定方法，如比色法、熒光法和凝膠擴散法等。但這些方法仍需要依賴于底物，并且可能會對酶本身造成損害。因此，采用一種無損、操作簡單且快速測量普魯蘭酶活性的方法對于監(jiān)測反應過程至關重要[1]。

參考文獻

[1] 李爽爽. 基于中紅外和近紅外光譜技術的普魯蘭酶活性表征與定量分析研究[D]. 山東:山東大學,2024.