介紹

2,2’-(1,2-乙二基雙氧代)雙乙硫醇又被稱為3,6-二氧雜-1,8-辛二硫醇（3,6-dioxa-1,8-octanedithiol，DODT），可以作為無(wú)臭型硫醇清除劑，被廣泛推薦替代乙二硫醇（EDT）用于Fmoc固相多肽合成（Fmoc-SPPS）的三氟乙酸（TFA）切割步驟，以抑制氨基酸殘基烷基化、氧化等副反應(yīng)。DODT在含甲硫氨酸多肽的切割中存在嚴(yán)重的特異性副反應(yīng)。

圖一 2,2’-(1,2-乙二基雙氧代)雙乙硫醇

甲硫氨酸烷基化副反應(yīng)

以11條含甲硫氨酸多肽為模型，采用2,2’-(1,2-乙二基雙氧代)雙乙硫醇切割液進(jìn)行TFA酸解后，LC-MS檢測(cè)顯示所有產(chǎn)物均出現(xiàn)+117Da主雜質(zhì)，同時(shí)伴隨少量+57Da叔丁基化雜質(zhì)；部分多肽中+117Da雜質(zhì)占比高達(dá)50%，且與目標(biāo)肽共洗脫，常規(guī)反相高效液相色譜（RP-HPLC）無(wú)法有效分離。副反應(yīng)為DODT與甲硫氨酸的特異性反應(yīng)，與多肽合成路線無(wú)關(guān)。

通過(guò)短肽模型（GMTNY）分離純化副產(chǎn)物，結(jié)合1HNMR、13CNMR及二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）解析，修飾位點(diǎn)為甲硫氨酸的硫醚硫原子，生成叔丁基乙硫醚锍鹽衍生物；+117Da的質(zhì)量增量對(duì)應(yīng)叔丁基-乙硫醚基團(tuán)，MS/MS碎片中57Da特征峰驗(yàn)證了叔丁基結(jié)構(gòu)的存在。NMR數(shù)據(jù)顯示，甲硫氨酸甲基氫化學(xué)位移從2.1ppm偏移至2.97ppm，碳信號(hào)從14.1ppm偏移至22.5ppm，直接證明硫原子的烷基化修飾；同時(shí)，手性锍鹽的生成導(dǎo)致相鄰碳信號(hào)裂分。

2,2’-(1,2-乙二基雙氧代)雙乙硫醇的醚氧鍵在TFA強(qiáng)酸性條件下發(fā)生環(huán)化，生成硫雜環(huán)丙烷或環(huán)狀縮醛中間體，經(jīng)開(kāi)環(huán)反應(yīng)與甲硫氨酸硫原子發(fā)生親核烷基化，是副反應(yīng)的核心路徑。醚氧結(jié)構(gòu)是反應(yīng)發(fā)生的必要條件：無(wú)醚鍵的ODT僅產(chǎn)生常規(guī)叔丁基化雜質(zhì)，無(wú)117Da衍生化產(chǎn)物；而絲氨酸、蘇氨酸鄰近甲硫氨酸雖會(huì)加劇副反應(yīng)，但并非必要條件。

清除劑與氨基酸原料優(yōu)化

含甲硫氨酸多肽優(yōu)先選用EDT替代2,2’-(1,2-乙二基雙氧代)雙乙硫醇，或采用ODT作為無(wú)臭替代方案，二者均完全杜絕+117Da雜質(zhì)；使用Fmoc-Met(O)替代甲硫氨酸，亞砜結(jié)構(gòu)封閉硫原子親核活性，切割后無(wú)需額外還原即可獲得目標(biāo)肽，是最徹底的規(guī)避方法。

合成后去除

2,2’-(1,2-乙二基雙氧代)雙乙硫醇修飾產(chǎn)物具有酸不穩(wěn)定性，可通過(guò)后處理定量脫除：將粗肽溶于乙腈/水（1:1，v/v）含0.1%甲酸的溶液中，37℃保溫12~14h，可完全轉(zhuǎn)化為未修飾的目標(biāo)肽，無(wú)多肽降解與殘基異構(gòu)化。該方法條件溫和，優(yōu)于傳統(tǒng)高溫乙酸處理，適配酸敏感多肽序列[1]。

圖二 合成后去除

參考文獻(xiàn)

[1]Harris P W R, Kowalczyk R, Yang S H, et al. An important side reaction using the thiol, 3,6‐dioxa‐1,8‐octanedithiol (DODT), in 9‐fluorenylmethoxycarbonylbased solid phase peptide synthesis[J]. Journal of Peptide Science, 2014, 20(3): 186-190. DOI:10.1002/psc.2595