背景[1-6]
Novex 10-20%Tris-Glycine Mini Gels,WedgeWell format,12-well是濃度10-20%12孔聚丙烯酰胺凝膠，可將各種蛋白質(zhì)重復分離成具有兩倍負載能力的良好分辨的條帶。Novex Tris-Glycine Mini Gels基于傳統(tǒng)的Laemmli蛋白電泳，可以使用Laemmli樣品和運行緩沖液。
Novex Tris-甘氨酸凝膠的特性包括：
•改善保質(zhì)期-在4°C下長達6個月的儲存凝膠
•多樣性-用于原生和變性蛋白質(zhì)分析
•楔形孔-輕松加載多達兩倍的樣品量
•快速運行條件-在不到60分鐘內(nèi)使用恒定電壓快速分離蛋白質(zhì)
Novex 10-20%Tris-Glycine Mini Gels不含SDS，可用于以天然或變性形式運行蛋白質(zhì)。對于變性蛋白質(zhì)，建議使用Novex Tris-Glycine SDS樣品緩沖液和Novex Tris-甘氨酸SDS運行緩沖液。對于天然蛋白質(zhì)，我們建議使用Novex Tris-Glycine Native Sample Buffer和Novex Tris-Glycine Native Running Buffer。
特性[1]
Novex Tris-Glycine凝膠，WedgeWell格式，具有創(chuàng)新的楔形孔，其樣品負載量比其他1.0 mm厚的凝膠多兩倍。楔形井也有較大的開口，使樣品裝載更容易。
為了將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，建議在使用Invitrogen Mini Blot模塊進行傳統(tǒng)濕轉(zhuǎn)移時使用Novex Tris-Glycine Transfer Buffer。也可以使用快速半干轉(zhuǎn)移進行轉(zhuǎn)移使用iBlot 2凝膠轉(zhuǎn)移裝置進行Invitrogen Power Blotter或快速干轉(zhuǎn)移。
應用[7][8]
用于Fbxw7通過泛素化蛋白酶解YAP誘導肝癌細胞凋亡和生長停滯研究。
原發(fā)性肝癌(Primary liver cancer,PLC)是我國最常見的惡性腫瘤之一,病死率在各種癌癥病死率中居第2位,其中肝細胞癌占PLC的90%以上。HCC發(fā)病率逐年升高,隨著高危人群篩查、肝移植技術(shù)的成熟、影像學早期診斷以及經(jīng)動脈化療栓塞、射頻消融(Radiofrequency ablation,RFA)和索拉菲尼(Sorafenib)等輔助治療的臨床應用,HCC患者的預后較前已經(jīng)有了明顯的改善,但總體上還未取得令人滿意的療效。分子靶向藥物索拉菲尼的臨床應用彌補了晚期HCC患者治療手段的空缺,因此,進一步明確HCC發(fā)生發(fā)展涉及的精確分子機制,探索HCC早期診斷分子標志物、設(shè)計有效的腫瘤治療分子靶點以及患者預后指示標志物,對提高我國肝癌的治療水平和改善腫瘤患者預后具有重要意義。
泛素介導的蛋白質(zhì)降解通路是基因和蛋白質(zhì)功能的主要調(diào)節(jié)者和終結(jié)者,控制著真核細胞內(nèi)絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的降解,因此,對該通路的調(diào)控已成為疾病治療中的一種創(chuàng)新性方法。F框/WD-40域蛋白7(F-box and WD repeat domain-containing 7,Fbxw7)是SCF(Skpl-Cullinl-F-box)類泛素連接酶E3復合體中特異性識別底物的關(guān)鍵因子,能夠靶向泛素化降解CyclinE,c-Myc,c-Jun,Mcl-1(Myeloid cell leukemia-1)和Notch等癌蛋白,從而抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡并增加化療敏感性。
研究表明Fbxw7在多種惡性腫瘤中表達缺失,其低表達與患者不良預后密切相關(guān),是一種廣泛的抑癌基因。p53在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)Fbxw7基因達,p53-/+Fbxw7-/+基因敲除小鼠和受輻射的Fbxw7-/+小鼠均自發(fā)產(chǎn)生包括HCC在內(nèi)的多種腫瘤,提示Fbxw7與HCC的發(fā)生發(fā)展存在著某種聯(lián)系。
Fbxw7的多個靶蛋白如CyclinE,c-Myc,c-Jun和Notch等在HCC中存在表達異常,且與HCC增殖、凋亡、耐藥及不良預后密切相關(guān)。Hippo信號通路在哺乳動物中是一個高度保守有效的細胞生長和凋亡調(diào)控因子,在許多人類腫瘤特別是HCC中存在該通路的異常,而該通路的核心效應分子是Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein,YAP)。在HCC和乳腺癌中YAP被鑒定為位于11q22擴增子的一個促癌基因,YAP轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)肝臟體積明顯增大并最終產(chǎn)生腫瘤,臨床研究發(fā)現(xiàn)YAP是一個與HCC患者無病生存期和總生存期相關(guān)的獨立預測因素,提示Hippo-YAP信號通路在HCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著極其重要的作用。應用免疫組化染色、Western blot和qRT-PCR檢測Fbxw7在HCC及對應癌旁組織中的表達,分析Fbxw7與HCC臨床病理特征的相關(guān)性。
2.應用qRT-PCR鑒定Fbxw7 mRNA在永生化人肝細胞系L02和HCC細胞系HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Bel-7402及Huh7的表達水平。
3.應用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的Flag-Fbxw7和Fbxw7-shRNA分別轉(zhuǎn)染HepG2和Hep3B細胞,qRT-PCR和Western blot檢測Fbxw7表達變化,流式細胞術(shù)、Caspase3/7活性分析、BrdU細胞增殖分析和MTT法檢測細胞增殖和凋亡變化。
4.應用免疫組化染色檢測YAP在HCC及對應癌旁組織中的表達,分析YAP與Fbxw7蛋白蛋白表達相關(guān)性。
參考文獻
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[8]涂康生. Fbxw7通過泛素化蛋白酶解YAP誘導肝癌細胞凋亡和生長停滯[D].西安交通大學,2017.