介紹

毒蠅虎蕈鹼（Phalloidin, PH）是毒鵝膏（Amanita phalloides）產(chǎn)生的七種主要毒素之一，作為一種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的環(huán)七肽，它以對絲狀肌動蛋白（F-actin）的高特異性和高親和力結(jié)合特性聞名于世。它被廣泛用作細(xì)胞生物學(xué)中標(biāo)記和穩(wěn)定細(xì)胞骨架的標(biāo)準(zhǔn)工具。由七個氨基酸組成的雙環(huán)結(jié)構(gòu)組成，具有極高的化學(xué)穩(wěn)定性。它能以納摩爾級的親和力（Kd≈3×10?? M）特異性結(jié)合F-actin的亞基間界面，通過增強(qiáng)單體間的相互作用顯著抑制肌動蛋白絲的解聚，從而穩(wěn)定細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞骨架的熒光成像與定量分析、肌動蛋白聚合動力學(xué)研究，細(xì)胞遷移、分裂和形態(tài)發(fā)生過程的觀察、病理狀態(tài)下細(xì)胞骨架異常的檢測等等。

圖一 毒蠅虎蕈鹼

在骨骼肌中雙相張力反應(yīng)的分子機(jī)制

濃度依賴性

在 40-132 μM 的濃度范圍內(nèi)，部分激活的骨骼肌纖維對毒蠅虎蕈鹼的反應(yīng)均呈現(xiàn)典型的雙相特征：加入毒蠅虎蕈鹼后，張力首先在數(shù)分鐘內(nèi)下降至最低點(diǎn)，隨后逐漸回升至接近或超過初始水平。兩個反應(yīng)階段的潛伏期均與毒蠅虎蕈鹼濃度成反比，整個反應(yīng)的速率與毒蠅虎蕈鹼濃度成正比，校正自發(fā)張力衰減后，不同濃度下的反應(yīng)曲線可通過時間尺度縮放完全重合。毒蠅虎蕈鹼與肌動蛋白絲的結(jié)合是整個機(jī)械反應(yīng)的限速步驟，且結(jié)合過程不具有協(xié)同性。

順序結(jié)合機(jī)制

通過在激活前將肌纖維與毒蠅虎蕈鹼預(yù)孵育不同時間，發(fā)現(xiàn)預(yù)孵育 4 分鐘反應(yīng)仍保留雙相特征，但張力下降幅度減小，最低點(diǎn)提前；預(yù)孵育 5 分鐘反應(yīng)僅表現(xiàn)為張力上升；預(yù)孵育 10 分鐘加入毒蠅虎蕈鹼后立即出現(xiàn)最大速率的張力上升。這表明毒蠅虎蕈鹼與肌動蛋白絲的結(jié)合是一個順序性過程：首先結(jié)合特定位點(diǎn)導(dǎo)致張力下降，隨后結(jié)合其余位點(diǎn)導(dǎo)致張力上升。預(yù)孵育使毒蠅虎蕈鹼提前完成了第一階段的結(jié)合，因此后續(xù)僅表現(xiàn)出第二階段的反應(yīng)。

雙相反應(yīng)的分子基礎(chǔ)

為了確定不同階段毒蠅虎蕈鹼的結(jié)合位點(diǎn)，采用了負(fù)染色策略。先用未標(biāo)記的毒蠅虎蕈鹼預(yù)孵育肌纖維 5 分鐘（對應(yīng)張力最低點(diǎn)），再用羅丹明 - 毒蠅虎蕈鹼染色，通過熒光缺失區(qū)域確定預(yù)結(jié)合的毒蠅虎蕈鹼位置。無預(yù)孵育組熒光主要集中在 Z 線和 I 帶兩端（肌動蛋白絲尖端），預(yù)孵育 5 分鐘組的Z 線和 I 帶兩端的熒光被顯著抑制，熒光峰向 I 帶中央偏移張力下降階段：毒蠅虎蕈鹼結(jié)合于 Z 線區(qū)域和肌動蛋白絲的尖端（指向 M 線的一端），毒蠅虎蕈鹼結(jié)合于肌動蛋白絲的全長。

圖二 纖維的羅丹明熒光強(qiáng)度分布圖

作用機(jī)制

伴肌動蛋白是骨骼肌特有的巨大蛋白質(zhì)，沿肌動蛋白絲全長分布，被認(rèn)為是肌動蛋白絲長度的分子標(biāo)尺。伴肌動蛋白與毒蠅虎蕈鹼競爭肌動蛋白上的相同結(jié)合位點(diǎn)。毒蠅虎蕈鹼需要緩慢解開伴肌動蛋白與肌動蛋白的相互作用才能結(jié)合，這解釋了骨骼肌中反應(yīng)的緩慢動力學(xué)。而心肌中不存在伴肌動蛋白，因此毒蠅虎蕈鹼能快速均勻地結(jié)合肌動蛋白絲全長，僅表現(xiàn)為張力增強(qiáng)[1]。

參考文獻(xiàn)

[1]Bukatina A E, Fuchs F, Watkins S C. A study on the mechanism of phalloidin-induced tension changes in skinned rabbit psoas muscle fibres[J]. Journal of Muscle Research and Cell Motility, 1996, 17(3): 365-371.