介紹

乙酸-L-孟酯是L-薄荷醇最重要的酯類衍生物之一，憑借其清新柔和的薄荷香氣、持久的清涼感以及優(yōu)異的生物相容性，廣泛應(yīng)用于食品、日化、醫(yī)藥等多個領(lǐng)域。不同于化學(xué)合成得到的外消旋DL-乙酸薄荷酯，純L-型異構(gòu)體具有純正的清涼風(fēng)味，而D-型異構(gòu)體則帶有苦澀異味，嚴(yán)重影響產(chǎn)品品質(zhì)。

圖一 乙酸-L-孟酯

合成現(xiàn)狀

乙酸-L-孟酯天然存在于薄荷油、香紫蘇油等植物精油中，但天然提取產(chǎn)量低、成本高，無法滿足工業(yè)大規(guī)模需求。工業(yè)上主要通過化學(xué)合成DL-薄荷醇后再進(jìn)行酯化反應(yīng)得到外消旋體，隨后通過拆分獲得L-型產(chǎn)物。然而，傳統(tǒng)化學(xué)拆分法存在諸多弊端：拆分試劑消耗量大、反應(yīng)條件苛刻（高溫高壓）、產(chǎn)生大量三廢、光學(xué)純度難以控制，且產(chǎn)物分離提純復(fù)雜，導(dǎo)致生產(chǎn)成本居高不下。相比之下，酶催化酯化反應(yīng)具有無可比擬的優(yōu)勢。脂肪酶（E.C.3.1.1.3）作為一類重要的水解酶，在有機(jī)介質(zhì)中能夠催化酯化、轉(zhuǎn)酯化等反應(yīng)，且對L-薄荷醇具有高度的立體選擇性。在有機(jī)體系中，脂肪酶不僅能保持良好的催化活性和穩(wěn)定性，還能避免微生物污染，同時提高疏水性底物的溶解度，使反應(yīng)向生成酯的方向進(jìn)行。其中，褶皺假絲酵母（Candidarugosa，舊稱Candidacylindracea）脂肪酶（CRL）因?qū)-薄荷醇的高選擇性而被廣泛研究。CRL包含LIP1-LIP7七種同工酶，不同同工酶的底物特異性差異顯著，其中LIP2對短鏈三酰甘油的催化活性最高，比活力可達(dá)2540U?mg?1（pH7.0），是合成乙酸-L-孟酯的理想生物催化劑。

固定化基因工程LIP2催化合成

為進(jìn)一步提高乙酸-L-孟酯的合成效率和光學(xué)純度，以基因工程改造的CRLLIP2為催化劑，采用響應(yīng)面法（RSM）結(jié)合中心復(fù)合旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)（CCRD），系統(tǒng)優(yōu)化了固定化LIP2催化DL-薄荷醇與三乙酸甘油酯酯化合成L-乙酸薄荷酯的反應(yīng)條件。

催化劑的選擇與預(yù)處理

對比了商業(yè)CRL（AmanoAY-30）、游離基因工程LIP2和DEAE-SephadexA-25固定化LIP2的催化活性。結(jié)果顯示，固定化LIP2的酯化活性顯著高于游離酶和商業(yè)酶。這是因?yàn)楣潭ɑ粌H提高了酶的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性，還通過載體的吸附作用減少了酶分子的聚集，使活性中心更易與底物接觸。所有反應(yīng)試劑均預(yù)先用4?分子篩脫水24小時，以消除水分對乙酸-L-孟酯酯化反應(yīng)平衡的不利影響。

反應(yīng)條件優(yōu)化

為了考察乙酸-L-孟酯的綠色合成酯化反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件，采用五水平四因子CCRD設(shè)計(jì)，考察了反應(yīng)時間（1-3天）、反應(yīng)溫度（15-55℃）、酶用量（50-250%w/w，以DL-薄荷醇質(zhì)量計(jì)）和底物摩爾比（DL-薄荷醇：三乙酸甘油酯=1:0.5-1:2.5）四個關(guān)鍵變量對摩爾轉(zhuǎn)化率的影響。通過SAS軟件的RSREG程序擬合得到二階多項(xiàng)式模型，該模型的決定系數(shù)R2=0.941，且p值<0.0001，表明模型具有極高的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，能夠準(zhǔn)確預(yù)測反應(yīng)結(jié)果。底物摩爾比、酶用量和反應(yīng)溫度是影響轉(zhuǎn)化率的最主要因素（p<0.01），而反應(yīng)時間的影響相對較小。隨著三乙酸甘油酯比例的增加，轉(zhuǎn)化率顯著提高。這是因?yàn)轷セ磻?yīng)是可逆反應(yīng)，過量的酰基供體能夠推動反應(yīng)平衡向生成酯的方向移動。轉(zhuǎn)化率隨酶用量的增加而快速上升，當(dāng)酶用量達(dá)到200%w/w時，轉(zhuǎn)化率趨于穩(wěn)定，繼續(xù)增加酶量對轉(zhuǎn)化率的提升效果不明顯。最佳反應(yīng)溫度約為34℃，溫度過高會導(dǎo)致酶蛋白變性失活，溫度過低則反應(yīng)速率緩慢。

最優(yōu)反應(yīng)條件

通過脊嶺最大值分析（RidgeMaxAnalysis）確定了最優(yōu)反應(yīng)條件：反應(yīng)時間2.2天，反應(yīng)溫度34.3℃，酶用量0.09g（200%w/w），底物摩爾比1:1.9（DL-薄荷醇：三乙酸甘油酯）。在該條件下，理論預(yù)測摩爾轉(zhuǎn)化率為50%，實(shí)際實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證值為48.3%，與預(yù)測值無顯著差異（χ2檢驗(yàn)，p=0.961）。同時，產(chǎn)物乙酸-L-孟酯的對映體過量值（ee）最高可達(dá)95.11%。

圖二 摩爾轉(zhuǎn)化率的估計(jì)最大響應(yīng)脊

優(yōu)勢

固定化LIP2對L-薄荷醇的專一性強(qiáng)，產(chǎn)物乙酸-L-孟酯光學(xué)純度高，無需復(fù)雜的后續(xù)拆分步驟。在常溫常壓下進(jìn)行，能耗低，設(shè)備要求簡單，且避免了高溫高壓下副反應(yīng)的發(fā)生。以正己烷為溶劑，三乙酸甘油酯為酰基供體，反應(yīng)過程無有毒有害物質(zhì)產(chǎn)生，符合綠色化學(xué)的發(fā)展理念。DEAE-SephadexA-25固定化酶穩(wěn)定性好，經(jīng)過多次循環(huán)使用后仍能保持較高的催化活性，大幅降低了生產(chǎn)成本[1]。

參考文獻(xiàn)

[1] CHEN H C, LIANG Y T, CHEN J H, et al. Optimization of immobilized Candida rugosa lipase LIP2-catalyzed resolution to produce L-menthyl acetate[J]. Biocatalysis and Biotransformation, 2009, 27(5-6): 296-302. DOI:10.3109/10242420903204607.