惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的常見疾病之一，并呈逐年上升的趨勢。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的兩個最主要的生物學(xué)特征和標(biāo)志，也是腫瘤患者治療失敗和死亡的根本原因。目前，傳統(tǒng)細(xì)胞毒性藥物仍將是抗腫瘤轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的主體，細(xì)胞毒性藥物抗腫瘤療效顯著，但是它殺傷腫瘤細(xì)胞的同時也殺傷了正常細(xì)胞，因此，研發(fā)新的低毒高效抗腫瘤靶向藥物是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的一個重要前沿。4-甲基-3-硝基苯甲酸是從以五種分子結(jié)構(gòu)為母體的小分子化合物庫中篩選得到的，初步體外實驗證實其能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞的運動。
實驗方法[1]
1、細(xì)胞培養(yǎng)
上述細(xì)胞用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(不含抗生素),在37℃,5%CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),0.25%胰酶消化傳代。
2、急性毒性實驗
實驗采用昆明種小鼠,體重18~22g,雌雄各半。在藥物溶解達(dá)飽和度時達(dá)最大濃度,經(jīng)腹腔注射4-甲基-3-硝基苯甲酸溶液,找出引起小鼠100%和0死亡的劑量,探索得到的劑量范圍為:在621.5mg/kg和932.7mg/kg之間,由于藥物達(dá)到所能配制的最大濃度為26.65mg/mL,給藥體積設(shè)定為0.35mL/10g。將80只昆明種小鼠隨機(jī)分為8組，每組10只,雌雄各半。4-甲基-3-硝基苯甲酸在各組劑量按等比數(shù)列排列,將各組藥物配成一定濃度，對其體內(nèi)毒性進(jìn)行檢測。
3、趨化實驗
首先將不同的腫瘤細(xì)胞分別接種到35mm的培養(yǎng)皿中,使其貼壁生長。各加入不同濃度的4-甲基-3-硝基苯甲酸作用24h后,消化、計數(shù)調(diào)整細(xì)胞數(shù)為0.5x105個/mL。在趨化小室下室加入30uL孔終濃度為10ng/mL的EGF,未加EGF作對照;取孔徑為10um的聚碳酸酯膜0.001% Fibronectin包被后置于趨化小室的上下室之間,在上室分別加入上述細(xì)胞懸液,50uL孔。將趨化小室放在37℃,5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h。然后取碳酸酯膜,刮洗掉沒有穿過膜的細(xì)胞,將膜固定染色后,在倒置顯微鏡下隨機(jī)取3個視野(40x),并計數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù),趨化指數(shù)=EGF刺激后穿膜細(xì)胞數(shù)/無EGF刺激穿膜細(xì)胞數(shù)。
4、動物實驗
無菌條件下,取2只生長旺盛、無破潰的BL6-B16荷瘤小鼠,頸椎脫臼處死,在無菌條件下剝離腫瘤,用剪刀將腫瘤剪成小碎塊,放入無菌的玻璃勻漿器,生理鹽水按體積1:10稀釋研磨后,用80目濾網(wǎng)過濾。將混勻的腫瘤細(xì)胞懸液接種于4~6周齡,雌性,C57小鼠右前肢腋部皮下,每只小鼠接種細(xì)胞1x107個。18只小鼠隨機(jī)分成4-甲基-3-硝基苯甲酸組(200mg/kg)和對照組(0mg/kg),毎組9只,每日1次灌胃給藥,用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長短徑,計算腫瘤體積。給藥14天后結(jié)束實驗,留取瘤塊,依據(jù)瘤塊重量和測量體積評價藥物療效。數(shù)據(jù)用x±s表示;腫瘤生長抑制率(瘤重)=(對照組瘤重-給藥組瘤重)/對照組瘤重x100%;腫瘤生長抑制率(瘤體積)=(對照組瘤體積-給藥組瘤體積)對照組瘤體積x100%;腫瘤體積計算方法,腫瘤體積V:V=1/2xaxb2(a為腫瘤的長徑,b為腫瘤的短徑)。同時,對其體重進(jìn)行監(jiān)測,觀察藥物毒性反應(yīng)。
實驗結(jié)果
1、急性毒性實驗
小鼠體內(nèi)急性毒性實驗結(jié)果顯示,4-甲基-3-硝基苯甲酸的半數(shù)致死量LD50為771.73mg/kg。半數(shù)致死量LD50的95%置信區(qū)間為729.73~816.15mg/kg。4-甲基-3-硝基苯甲酸在體內(nèi)是低毒性的,具有生物安全性。
2、趨化實驗
在肺癌細(xì)胞A549、肝癌細(xì)胞SSMC-7721、惡性黑色素瘤細(xì)胞LiBr、胃癌細(xì)胞MGC-803在EGF 10ng/mL作用下,趨化3h后,計數(shù)4-甲基-3-硝基苯甲酸處理24h后,經(jīng)EGF刺激因子趨化穿透膜的細(xì)胞數(shù),計算趨化指數(shù)作圖后,結(jié)果顯示,4-甲基-3-硝基苯甲酸可以抑制上述細(xì)胞在EGF誘導(dǎo)下的趨化運動能力,抑制作用隨藥物濃度增加而增強(qiáng),如圖所示,4-甲基-3-硝基苯甲酸的最適作用濃度在2.0uM。
3、動物實驗
4-甲基-3-硝基苯甲酸可以抑制BL6-B16小鼠黑色素移植瘤生長。4-甲基-3-硝基苯甲酸給藥組對BL6-B16小鼠黑色素移植瘤生長產(chǎn)生明顯的抑制作用,腫瘤體積(P<0.05)和重量(P<0.01)顯著低于對照組。4-甲基-3-硝基苯甲酸給藥組小鼠均未見急性毒性反應(yīng);動物活動正常,與對照組相比,體重增長一致,實驗期間各實驗組動物均未死亡。
參考文獻(xiàn)
[1] 李萌輝,張飛,郭華,等. 細(xì)胞運動抑制劑4-甲基-3-硝基-苯甲酸的基礎(chǔ)研究[J]. 中國腫瘤臨床,2010,37(11):601-604. DOI:10.3969/j.issn.1000-8179.2010.11.001.