概述[1]
反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase,也可寫成逆轉(zhuǎn)錄酶)又稱為依賴RNA 的DNA 聚合酶。1970 年Temin 等在致癌RNA 病毒中發(fā)現(xiàn)了一種特殊的DNA 聚合酶，該酶以RNA 為模板，以dNTP 為底物，tRNA( 主要是色氨酸t(yī)RNA) 為引物，在tRNA 3'-OH 末端上，根據(jù)堿基配對的原則，按5'-3'方向合成一條與RNA 模板互補的DNA 單鏈，這條DNA 單鏈叫做互補DNA (complementary DNA，CDNA)。
反轉(zhuǎn)錄酶（Reverse transcriptase）是以RNA為模板指導三磷酸脫氧核苷酸合成互補DNA（cDNA）的酶。哺乳類C型病毒的反轉(zhuǎn)錄酶和鼠類B型病毒的反轉(zhuǎn)錄酶都是一條多肽鏈。鳥類RNA病毒的反轉(zhuǎn)錄酶則由兩上亞基結(jié)構(gòu)。真核生物中也都分離出具有不同結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄酶。
主要用途[2,3]
為了探究人參皂普生物合成途徑與功能基因表達量之間的關(guān)系，首要的問題是提取完整性好、純度高的總RNA。由于植物細胞組成成分復雜多樣，使得植物組織總RNA的提取難于其他生物材料。成熟的人參組織中含有大量的酚類、糖類，人參組織的研磨過程破壞了酚類物質(zhì)與多酚氧化酶的平衡分布，酚類極易被氧化成醒，并易與RNA分子發(fā)生不可逆結(jié)合，產(chǎn)生褐化反應，從而影響RNA的提取，導致RNA的產(chǎn)量、質(zhì)量較差。本研究比較了7種提取人參根、葉片總RNA的方法，篩選出適合提取人參根、葉片總RNA的提取方法，并用該方法提取出完整性好、純度高的總RNA。反轉(zhuǎn)錄可以檢測提取的總RNA質(zhì)量，反轉(zhuǎn)錄酶的不同直接決定反轉(zhuǎn)錄效果，本試驗比較了3種反轉(zhuǎn)錄酶對總RNA的轉(zhuǎn)錄情況，篩選出轉(zhuǎn)錄效果較好的方法，為人參皂普合成途徑中功能基因的克隆與功能研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。
不同反轉(zhuǎn)錄酶合成DNA的檢測:
以PrimeSciript ReverseTransciriptase試劑盒、Reverse Tran-sciriptase M一MLV(RNaseH一)試劑盒、(osoril、trhiGoSciriptReverseTranscription System試劑盒對RNAPure高純總RNA快速提取試劑盒提取的人參根總RNA進行反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，采用PgSSI基因的引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖所示。
經(jīng)PrimeSciript Reverse Transciriptase試劑盒、Reverse Tran-sciriptase M一MLV ( RNase H一)試劑盒、(;osoril、trhiGoSciript ReverseTranscription System試劑盒對人參根總RNA進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，根據(jù)已報道的人參PgSSI基因設(shè)計引物: PgSSIF,5'-AAATGGGAAGTTTGGGGGC一3';PgSSI R,5’一(GGGTTCT-CACTGTTTGTTCAG -3';在PgSSI基因的引物下進行的PCR均能得到1條堿基數(shù)在1000-2000bp之間的片段，且條帶清晰;而經(jīng)GoSciript，Reverse Transcription System試劑盒反轉(zhuǎn)錄的cDNA擴增出的片段亮度明顯高于PrimeSciript Reverse Transciriptase試劑盒、Reverse Transcriptase M一MLV ( RNaseH一)試劑盒，而且沒有拖帶現(xiàn)象，證明其專一性比較強，反轉(zhuǎn)錄效率較高，但是3種方法得到的cDNA均可用于后續(xù)的分子研究。
人端粒酶是一種核糖核蛋白復合物，為端粒酶催化亞基，是控制酶活性的關(guān)鍵部分。很多關(guān)于端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的研究均說明端粒酶的活性、端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的水平與動物神經(jīng)元的生死存亡有著一定的聯(lián)系，且在細胞永生化及惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到了重要的作用。近些年來關(guān)于糖尿病的再生替代療法受到醫(yī)學研究者們的重視，現(xiàn)已成為學者們關(guān)注的焦點。目前治療糖尿病的方法主要有胰島移植、胰腺移植以及干細胞移植，其中骨髓間充質(zhì)干細胞移植引起人們更多的關(guān)注。骨髓間充質(zhì)干細胞是山中胚層發(fā)育的早期細胞，具有多向分化潛能，現(xiàn)已被證明可在體外誘導分化為成骨細胞、軟骨細胞、神經(jīng)細胞、脂肪細胞、心肌細胞等。此外，已有動物實驗證明骨髓間充質(zhì)干細胞可以恢復糖尿病大鼠的胰島功能，糾正其高血糖，這一機制可能與促進自體胰腺干細胞再分化有關(guān)。目前已有多項研究證實了骨髓源性干細胞在特定條件下可被誘導分化成胰島素分泌細胞。劉佳等主要觀察人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞對SD大鼠糖尿病的治療效果。
參考文獻
[1]牛建蕊,高志強,蒲靜,張偉,劉環(huán),劉文曉,張鶴曉.動物RNA病毒檢測關(guān)鍵試劑—反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV RTase)的制備[J].中國獸醫(yī)雜志,2016,52(11):26-28+50.
[2]張濤,韓梅,劉翠晶,胥苗苗.人參總RNA提取方法及反轉(zhuǎn)錄酶的比較[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2015,43(08):34-37.
[3]劉佳.人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因修飾骨髓間充質(zhì)干細胞靜脈移植治療糖尿病[J].中國組織工程研究,2015,19(28):4549-4554.