一、GSH/GSSG比率的生物學(xué)意義
細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽主要以還原型（GSH）和氧化型（GSSG）兩種形式存在。GSH是細(xì)胞內(nèi)最豐富的非蛋白巰基化合物，在清楚活性氧自由基，維持氧化還原平衡機(jī)解毒代謝重發(fā)揮核心保護(hù)作用。當(dāng)細(xì)胞暴露于氧化應(yīng)激時，GSH被氧化為GSSG，導(dǎo)致GSH/GSSG比率下降。在谷胱甘肽還原酶催化下，GSSG可被重新還原為GSH，同時伴隨β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的氧化。因此，生物樣品中GSH/GSSG比率及GSSG含量的精準(zhǔn)測定，是評估細(xì)胞和組織氧化應(yīng)激狀態(tài)及解毒能力的關(guān)鍵指標(biāo)。
目前市售試劑盒普遍存在靈敏度不足或操作流程繁瑣的問題，難以滿足微量樣品檢測與高通量篩選的需求。
二、檢測原理與核心性能指標(biāo)
由艾美捷代理AAT Bioquest推出的Amplite? 快速熒光法GSH/GSSG比率檢測試劑盒（綠色熒光），貨號：AAT-10060，采用專有的水溶性非熒光探針Thiolite? Green 520WS，該探針與游離巰基反應(yīng)后產(chǎn)生強烈綠色熒光信號，激發(fā)/發(fā)射波長為490/525 nm（推薦截止濾光片515 nm）。
核心性能指標(biāo)：
-檢測下限低至1 pmol（以半胱氨酸或GSH計，100 μL體系對應(yīng)10 nM濃度）
-一步法操作，無需分離步驟
-適配96孔或384孔黑色微孔板，兼容自動化高通量平臺
-GSH和GSSG標(biāo)準(zhǔn)品獨立配制，分別建立標(biāo)準(zhǔn)曲線
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三、操作流程與關(guān)鍵參數(shù)
3.1 儀器與材料要求
項目?| 規(guī)格
檢測儀器?| 熒光微孔板讀數(shù)儀
激發(fā)波長?| 490 nm
發(fā)射波長?| 525 nm
截止濾光片?| 515 nm
推薦板型?| 實心黑色微孔板
重要提示：實驗開始前將所有組分恢復(fù)至室溫。所有配置后的儲備液應(yīng)分裝單次用量，于-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融。
3.2 儲備液配制
GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mM）：向GSH標(biāo)準(zhǔn)品（組分C）小管中加入200 μL Assay Buffer（組分B），配制成1 mM（1 nmol/μL）GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液。
GSSG標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1 mM）：向GSSG標(biāo)準(zhǔn)品（組分E）小管中加入200 μL ddH?O，配制成1 mM（1 nmol/μL）GSSG標(biāo)準(zhǔn)溶液。
Thiolite? Green 520WS儲備液（100×）：向Thiolite? Green 520WS（組分A）小管中加入100 μL ddH?O，配制成100×儲備液。
> 注意：儲備液及工作液均需避光保存。
3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備
GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線（0 ~ 10 μM）：
取10 μL的1 mM GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入990 μL Assay Buffer，配制成10 μM（10 pmol/μL）GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液（GSH7）。取10 μM GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液，用Assay Buffer進(jìn)行1:2梯度稀釋，得到GSH6 ~ GSH1系列標(biāo)準(zhǔn)品。
GSSG標(biāo)準(zhǔn)曲線（0 ~ 5 μM）：
取10 μL的1 mM GSSG標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入990 μL Assay Buffer，配制成10 μM（10 pmol/μL）GSSG標(biāo)準(zhǔn)溶液（GSSG7）。取10 μM GSSG標(biāo)準(zhǔn)溶液，用Assay Buffer進(jìn)行1:2梯度稀釋，得到GSSG6 ~ GSSG1系列標(biāo)準(zhǔn)品。
> 注意：稀釋后的GSH和GSSG標(biāo)準(zhǔn)溶液均不穩(wěn)定，建議配制后4小時內(nèi)使用。
3.4 檢測流程
1. 每孔加入50 μL Thiolite? Green工作溶液；
2. 加入50 μL GSH標(biāo)準(zhǔn)品、GSSG標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品；
3. 室溫孵育10 ~ 60分鐘；
4. 在Ex/Em = 490/525 nm處監(jiān)測熒光強度增加值。
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四、方法學(xué)驗證與質(zhì)量控制
靈敏度驗證：本方法在100 μL體系中檢測下限達(dá)10 nM（1 pmol/孔），適用于細(xì)胞裂解液、組織勻漿等低濃度樣品分析。
線性范圍：GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.01 ~ 10 μM范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系（R2 > 0.99），GSSG標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.005 ~ 5 μM范圍內(nèi)線性良好。
特異性：Thiolite? Green探針特異性響應(yīng)游離巰基。GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線用于定量樣品中的總游離巰基含量，GSSG標(biāo)準(zhǔn)曲線則用于氧化型谷胱甘肽的定量。
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五、常見問題與操作要點
1. 還原劑干擾：樣品中若含DTT、β-巰基乙醇或TCEP，需預(yù)先脫鹽處理，否則會導(dǎo)致假陽性信號。
2. pH控制：反應(yīng)體系pH建議維持在7.0 ~ 8.0之間，偏離此范圍可能影響探針反應(yīng)效率。
3. 孵育時間優(yōu)化：高濃度樣品（>10 μM）孵育10分鐘即可達(dá)到平臺期，低濃度樣品（<1 μM）建議延長至60分鐘。
4. 樣品制備：細(xì)胞或組織樣品需快速處理，避免GSH在制備過程中被氧化。建議在含EDTA的緩沖液中裂解，并盡量在冰上操作。
5. 背景扣除：每個實驗板應(yīng)包含空白對照（不含GSH/GSSG），最終熒光信號為實測值減去空白對照值。
六、總結(jié)
Amplite? 快速熒光法GSH/GSSG比率檢測試劑盒以“開啟型”熒光探針為核心技術(shù)，提供了一種高靈敏度、操作簡便的GSH/GSSG比率測定方案。1 pmol級的檢測下限使其適用于珍貴樣品的氧化應(yīng)激狀態(tài)評估，為抗氧化藥物篩選、毒理學(xué)研究和代謝性疾病機(jī)制探索提供了高效可靠的工具。