檢驗原理

采用特異性引物及熒光染料（如SYBR Green I），靶向肺炎克雷伯菌保守基因序列（如phoE或rpoB基因），通過實時熒光定量PCR技術檢測病原體核酸。靈敏度可達100拷貝/反應，線性范圍覆蓋10^1~10^6拷貝/μL，配套陽性對照（非傳染性DNA片段）以排除假陰性。

試劑盒組成

反應液：預混PCR緩沖液、dNTPs、熒光染料

酶混合液：熱啟動Taq DNA聚合酶

陽性質控品：肺炎克雷伯菌特異性DNA片段

陰性質控品：無核酸酶水

標準曲線樣品（6梯度稀釋，可選配）

適用儀器

兼容主流熒光定量PCR儀，包括：

ABI 7500/QuantStudio系列

安捷倫MX3000P/3005P

Bio-Rad CFX系列

Roche LightCycler 480

樣本要求

樣本類型：痰液、血液、腦脊液等臨床樣本或培養(yǎng)物

DNA提?。盒枳詡銬NA提取試劑盒，建議濃度≥10 ng/μL，OD260/280為1.7~2.0

操作步驟

試劑準備區(qū)

冰上解凍試劑，短暫離心后混勻。

按反應體系配制Master Mix（含反應液、酶液），分裝至PCR管。

樣本加樣區(qū)

加入5 μL模板DNA（樣本/陰陽性對照）。

擴增程序（以ABI 7500為例）：

預變性：95℃ 2分鐘

40循環(huán)：95℃ 15秒 → 60℃ 30秒（采集熒光）

結果判讀

定性分析：Ct值≤35且擴增曲線呈S型為陽性。

定量分析：通過標準曲線計算拷貝數(shù)。

注意事項

嚴格分區(qū)操作（試劑準備、樣本處理、擴增區(qū)），避免污染。

陽性質控品需單獨稀釋，避免氣溶膠擴散。

臨床樣本需符合生物安全規(guī)范，廢棄物料需高壓滅菌處理。

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