本試劑盒為伯克氏菌屬通用型檢測(cè)試劑，靶向伯克氏菌屬細(xì)菌高度保守基因，可廣譜檢測(cè)該屬各類致病菌種的核酸，適配土壤、水體、動(dòng)植物組織、養(yǎng)殖環(huán)境等多種樣本。試劑盒通用性廣、靈敏度高，可快速完成伯克氏菌屬病原的初步篩查與鑒別。適用于農(nóng)業(yè)、畜牧、環(huán)境領(lǐng)域的病原監(jiān)測(cè)、病害溯源、菌群分布調(diào)研及批量樣本快速檢測(cè)。
產(chǎn)品名稱 | 伯克氏菌通用PCR檢測(cè)試劑盒 | 貨號(hào) | YS-P013969 |
英文名稱 | Burkholderia spp.PCR | 規(guī)格 | 50T |
有效期 | 12個(gè)月 | 保存 | -20℃保存 |
基礎(chǔ)原理：
伯克氏菌屬保守 16S rRNA 基因通用引物 qPCR，廣譜檢出全部伯克氏菌屬菌種。
通用普通 PCR 擴(kuò)增細(xì)菌同源外膜蛋白基因，任意伯克氏菌均可擴(kuò)增目標(biāo)條帶。
通用染料熒光 PCR，先篩查伯克氏菌屬陽性，再用種特異性引物細(xì)分菌種。
?操作步驟?：
DNA提取（樣本制備區(qū)）
使用自選方法或兼容的核酸提取試劑盒純化樣本DNA，確保無抑制劑殘留。
標(biāo)準(zhǔn)曲線制備（樣本制備區(qū)）
標(biāo)記6支離心管為7至2號(hào)，每管加入45 μL DEPC-H2O（需使用帶濾芯槍頭）。
梯度稀釋陽性對(duì)照：
7號(hào)管：加入5 μL 1×10^8拷貝/μL陽性對(duì)照，震蕩混勻，得1×10^7拷貝/μL標(biāo)準(zhǔn)品；
依次稀釋至2號(hào)管，最終濃度跨5個(gè)數(shù)量級(jí)（1×10^7至1×10^3拷貝/μL）。
所有標(biāo)準(zhǔn)品置于冰上備用，避免反復(fù)凍融。
試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
反應(yīng)液避光解凍后渦旋混勻，短暫離心分裝至PCR管。
每反應(yīng)體系20 μL，含預(yù)混引物、熒光染料及緩沖液。
加樣（樣本處理區(qū)）
分別加入5 μL待測(cè)DNA或標(biāo)準(zhǔn)品至反應(yīng)管，陰性對(duì)照以DEPC-H2O替代。
蓋緊管蓋，避免氣泡干擾。
PCR擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）
按以下程序運(yùn)行定量PCR儀：
預(yù)變性：95℃ 2分鐘；
循環(huán)階段（40次）：95℃ 15秒 → 60℃ 30秒（采集熒光信號(hào)）；
熔解曲線分析（可選）。
?注意事項(xiàng)?：
試劑盒含生物源性質(zhì)粒模板，操作全程佩戴手套、口罩，陽性模板僅在生物安全柜開蓋；
所有一次性耗材、PCR 廢液、電泳凝膠實(shí)驗(yàn)后 121℃高壓滅菌再丟棄；
試劑避免反復(fù)凍融，單次融化冰上放置不超過 2 h，使用完畢立即放回 - 20℃；
移液器吸頭一次性使用，禁止重復(fù)吸取，防止交叉污染；
試劑盒僅用于科研檢測(cè)，嚴(yán)禁人臨床體外診斷；
擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)產(chǎn)物不可帶回試劑、提取區(qū)，防止氣溶膠大面積污染實(shí)驗(yàn)室；
若陰性對(duì)照持續(xù)出現(xiàn)雜帶，全部更換全新試劑盒，實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面、移液器紫外過夜消毒。
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