本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法原理，先將純化的大鼠GnRH特異性抗體包被于酶標板微孔中，形成固相抗體，隨后加入標準品、待測大鼠樣本，樣本中的GnRH會與固相抗體特異性結(jié)合，洗滌去除未結(jié)合雜質(zhì)后，加入辣根過氧化物酶標記的GnRH檢測抗體，形成固相抗體-抗原-酶標抗體的免疫復合物，再次洗滌除去游離酶標抗體，加入底物顯色液進行顯色反應，最后加入終止液終止反應，通過酶標儀測定各孔吸光度值，結(jié)合標準曲線即可精準計算出樣本中大鼠GnRH的含量。
基本參數(shù)?：
產(chǎn)品名稱：大鼠促性腺激素釋放激素(GnRH)ELISA試劑盒
英文名稱：GnRH ELISA Kit
貨號：Y-E1430
規(guī)格：48T/96T
靈敏度：最低檢測靈敏度≤1.0pg/mL
檢測范圍：2.5pg/mL - 80pg/mL
反應時間：總反應時長90分鐘（溫育60分鐘、洗滌顯色30分鐘）
保存條件：2-8℃避光密封保存，禁止冷凍
有效期：未開封原裝試劑盒12個月
顯色系統(tǒng)：TMB雙組分顯色液，酶促底物顯色體系
檢測波長：450nm（主波長）、630nm（參比波長）
標準曲線繪制：以標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，采用四參數(shù)Logistic擬合繪制標準曲線
特異性：特異性識別大鼠GnRH，與小鼠、兔、人同源同源蛋白無交叉反應，無樣本內(nèi)雜蛋白干擾
重復性：板內(nèi)變異系數(shù)CV≤8%，板間變異系數(shù)CV≤10%
注意事項：實驗全程避免強光直射；標準品現(xiàn)配現(xiàn)用，稀釋后不可留存；洗滌需充分，避免非特異性吸附導致結(jié)果偏差；樣本溶血、脂血會干擾檢測結(jié)果，需使用清澈血清/血漿樣本。
通用注意事項：
樣本要求
血清、血漿避免嚴重溶血、脂血、黃疸；組織勻漿充分離心去除沉淀；樣本分裝凍存，反復凍融≥3 次會導致抗原降解，檢測值偏低。
溫度控制
孵育溫度嚴格 37℃，溫箱溫度波動、室溫過低會降低結(jié)合效率，背景升高、重復性變差。
避光操作
TMB 底物、酶結(jié)合物、神經(jīng)遞質(zhì) / 維生素類靶標樣本見光易氧化，顯色全程避光，試劑避光存放。
洗板規(guī)范
洗滌不充分會造成高背景、假陽性；拍干時使用干凈吸水紙，禁止交叉污染微孔。
污染防控
實驗耗材無 DNase、RNase、蛋白酶；槍頭一次性更換，標準品與樣本避免交叉加樣；底物液變色、出現(xiàn)沉淀不可使用。
安全防護
終止液含稀硫酸，具有腐蝕性，避免接觸皮膚、黏膜；實驗廢液集中收集中和后處理，不可直接傾倒。
失效判定
試劑盒超出有效期、試劑渾濁變色、標準品梯度無明顯顏色差異，均判定失效，禁止繼續(xù)實驗。
稀釋校正
樣本 OD 值高于最高標準孔時，必須稀釋重測，最終結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)；低于最低檢測限標注 “低于試劑盒靈敏度”。
空白對照
空白孔吸光度應極低，若空白孔 OD＞0.1，說明洗滌不充分或試劑污染，實驗作廢重做。
儲存禁忌
試劑盒不可冷凍結(jié)冰，冷凍會造成酶標抗體蛋白變性，直接導致試劑盒完全失效。
實驗步驟如下：
提前取出試劑盒所有試劑、大鼠待測血清樣本，室溫平衡 30min，濃縮洗滌液按 1:20 純水稀釋備用。
包被板設置空白孔、標準品梯度孔、待測樣本孔，空白孔加 100μL 樣本稀釋液，標準品孔依次加不同濃度 GnRH 標準品 100μL，樣本孔加入 100μL 大鼠血清，輕晃板條混勻。
每孔立刻加入 100μL 酶標記 GnRH 結(jié)合抗體，封板膜密封酶標板，37℃恒溫孵育 60min。
撕掉封板膜，傾倒孔內(nèi)液體，每孔加滿稀釋洗滌液靜置 30s 后甩干，重復洗滌 4 次，拍干殘留液體。
所有孔同步加入顯色底物 A、B 液各 50μL，避光環(huán)境 37℃顯色 15min，觀察標準品梯度藍色區(qū)分度。
每孔快速滴加 50μL 終止液，輕拍板底混勻，藍色液體轉(zhuǎn)為黃色即終止反應。
酶標儀設置 450nm 主波長、630nm 參比波長，10min 內(nèi)讀取各孔 OD 值，繪制標準曲線計算樣本 GnRH 濃度。
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