概述^[1]

本試劑盒專用于從血清(血漿)等液體樣品中提取病毒 RNA。本產(chǎn)品回收率極高，尤其適合于整合到臨床 RT-PCR 檢測(cè)試劑盒中。且能用于提取其他液體樣品和微量樣品。本產(chǎn)品具有以下特點(diǎn)：

1. 回收率高，可以達(dá)到90%以上，高于絕大部分基于離心柱的提取方法。

2. 靈敏度高，通過(guò)PCR檢測(cè)到的最終靈敏度可以達(dá)到50~100拷貝/ml。

3. 一管式操作，不使用離心柱，整個(gè)操作過(guò)程均在室溫下完成。

4. 安全無(wú)毒，不需要使用苯酚和氯仿等有機(jī)溶液。

5. 處理量大，如果加上病毒離心富集步驟，最多可以處理1.5 ml液體病毒樣品。

保存方法^[1]

常溫運(yùn)輸，4℃保存。

試劑準(zhǔn)備^[1]

1. 自備材料：小型高速離心機(jī)、離心管、異丙醇、70%乙醇等。

2. 血漿的抗凝劑必須是EDTA或ACD，不能是肝素。使用ACD時(shí)由于所加入ACD會(huì)增加體積，樣品會(huì)被稀釋，得到的病毒滴度會(huì)比使用EDTA低15%左右。

3. 用于制備血漿的全血在2~25°C放置的時(shí)間不能超過(guò)6小時(shí)，在此時(shí)間內(nèi)，可以室溫800-1600 g離心20分鐘，上清即為血漿。血漿可以在2~8°C或更低溫度下運(yùn)輸，可以在室溫放置一天，2~8°C放置5天，-20°C以下長(zhǎng)期保存。血漿按0.6mL/管的量分裝保存，以避免反復(fù)凍融。 

標(biāo)準(zhǔn)抽提步驟^[1]

1. 每管（包括正負(fù)對(duì)照管）中加入0.6 ml Buffer Rlysis-VG溶液（需提前融化）。

為避免污染，建議不要使用壓蓋式塑料離心管。注意設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

2. 快速震蕩樣品幾秒，再短暫離心，取0.2 ml液體樣品加入到已經(jīng)裝有0.6 ml Buffer Rlysis-VG溶液的離心管中。如果病毒需要富集，可以將1.5 ml液體樣品在4℃ 24,000 g冷凍離心60 min，移棄1.3 ml上清后作為樣品。

3. 在正負(fù)對(duì)照樣品管中分別加正負(fù)對(duì)照樣品。

4. 室溫放置10分鐘。此間可以在每個(gè)管上做個(gè)標(biāo)記，以在下步區(qū)別向心面和離心面。

5. 振蕩數(shù)秒后加入0.7 ml異丙醇，旋緊蓋后振蕩30 sec混勻，把離心管的向心面對(duì)向轉(zhuǎn)頭的中央，13,000~15,000 g室溫離

心至少15 min。

6. 小心移棄上清，注意不要觸及管底和管壁離心面的RNA沉淀。此時(shí)可能看不見(jiàn) RNA 沉淀。

7. 加入1.0 ml 70%乙醇，振蕩數(shù)秒后15,000 g室溫離心5 min。在離心機(jī)中放置離心管時(shí)將其向心面對(duì)向轉(zhuǎn)頭的中央。

8. 小心移棄上清，注意不要觸及管底和管壁離心面的RNA沉淀。此時(shí) RNA 呈膜狀沉淀。

9. 再短暫離心數(shù)秒, 用移液器移棄殘留液體（70%乙醇），否則它會(huì)影響后續(xù)反應(yīng)。

10. 加入200 μl Rnase-free水，用移液槍仔細(xì)吹打離心管管底和管壁離心面的膜狀RNA沉淀，溶液將呈混濁狀，含少量不溶物。由于不溶沉淀物中含有 RNA，所以不要離心后取上清使用，必須取混合液使用，哪怕很渾濁。

11. 樣品可以直接取適量用于RT-PCR，也可保存于-70°C長(zhǎng)期保存。

如果溶于 200 μl 水，同時(shí)樣品使用量不超過(guò) RT-PCR 體系的 1/2，不溶物一般不會(huì)影響 RT-PCR。剩余樣品可以室溫放置 2 小時(shí)，也可保存于-80°C 保存一個(gè)月。

主要參考資料

[1] 病毒 RNA 抽提純化試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書