背景[1-3]
病毒RNA提取試劑盒適合于從血清、細胞上清、淋巴液中提取RNA病毒基因組，不適合于細胞等組織內(nèi)RNA病毒基因組的提取。使用本試劑盒提取的基因組RNA可用于RT-PCR實驗。
病毒RNA提取試劑盒
操作步驟：
使用前請先在漂洗液中加入一瓶新開啟的無水乙醇，加入到離瓶口約0.5-1cm距離，蓋好搖勻。所有離心步驟均在2-8℃條件下進行。
1、取病毒上清液0.5ml，12000rpm離心5min，盡量吸盡上清使用，棄去沉淀（如無沉淀可省去此步）。
2、向病毒上清中加入20ul 10mg/ml的蛋白酶K，充分混勻，65℃消化10min，期間可顛倒離心管混勻數(shù)次。
3、吸附柱前處理：從包裝中取出吸附柱，放入收集管中，加入700ul洗柱液，室溫放置2分鐘，2-8℃12000 rpm離心2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中待用。
4、向病毒上清中加入500ul結(jié)合液，充分混勻。再向管中加入400ul無水乙醇，充分混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，不影響RNA的提取，可將溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱中，靜置2min。（吸附柱的容積為750ul，可分兩次加入。一次吸附完離心后再將余下的混合液體加入柱中靜置離心。）
5、12000rpm離心2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
6、向吸附柱中加入700ul漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心1min，棄
廢液，將吸附柱放入收集管中。
7、向吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
8、12000rpm離心2min，將吸附柱置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗
液去除，否則漂洗液中的乙醇會影響后續(xù)的實驗如酶切、PCR等。
9、將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加50ul-100ul經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的RNase free ddH2O，室溫放置5min，12000rpm離心2min。即可得到高質(zhì)量的病毒基因組RNA。
應(yīng)用[4][5]
用于牛病毒性腹瀉病毒持續(xù)性感染的分子機制研究及其定點突變株的構(gòu)建研究
探索BVDV NADL調(diào)控宿主細胞MDBK的細胞自噬和凋亡通路及自噬改變對BVDV NADL復(fù)制影響的分子機制,并探索利用反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建定點突變性BVDV毒株。
探索BVDV NADL影響MDBK細胞自噬的分子機制;探討MDBK細胞自噬水平改變后對BVDV復(fù)制的影響;探究miR-29b對BVDV NADL感染誘導(dǎo)的細胞自噬及BVDV NADL復(fù)制的影響;分析miR-29b對MDBK細胞凋亡的影響。
方法:（1）BVDV NADL感染GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MDBK細胞,在處理后不同時間,采用實時定量PCR、Western blot、激光共聚焦顯微鏡和透射電鏡等方法檢測細胞自噬相關(guān)蛋白表達水平和自噬活性變化;并構(gòu)建紅色熒光標記的BVDV NADL三個糖蛋白Erns、E1和E2基因過表達的慢病毒,使用相同方法檢測糖蛋白過表達對細胞自噬活性的影響;
（2）使用自噬抑制劑、促進劑和RNA干擾技術(shù)分別處理MDBK細胞,檢測細胞自噬水平的變化;并使用BVDV NADL感染自噬活性改變的MDBK細胞,檢測BVDV NADL mRNA水平變化;
（3）預(yù)測并鑒定miR-29b在自噬信號通路中靶基因ATG14和ATG9A;檢測pre-miR-29b過表達的慢病毒和BVDV NADL感染后靶蛋白表達水平、細胞自噬水平及BVDV NADL復(fù)制水平;并設(shè)計ATG14和ATG9A回補實驗,進一步驗證miR-29b通過下調(diào)靶蛋白ATG14和ATG9A的表達,進而影響B(tài)VDV NADL感染誘導(dǎo)的細胞自噬水平和BVDV的復(fù)制;
（4）預(yù)測和鑒定miR-29b在凋亡信號通路中的靶基因NAIF1和caspase-7;檢測miR-29b模擬物和抑制劑轉(zhuǎn)染后MDBK細胞凋亡水平及caspase-7和NAIF1 mRNA和蛋白表達水平;并設(shè)計caspase-7和NAIF1回補實驗,進一步證明miR-29b通過下調(diào)caspase-7和NAIF1的表達,進而影響凋亡水平。
參考文獻
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[3]Autophagy enhances the replication of classical swine fever virus in vitro[J].Jingjing Pei,Mingqiu Zhao,Zuodong Ye,Hongchao Gou,Jiaying Wang,Lin Yi,Xiaoying Dong,Wenjun Liu,Yongwen Luo,Ming Liao,Jinding Chen.Autophagy.2014(1)
[4]ATG9A overexpression is associated with disease recurrence and poor survival in patients with oral squamous cell carcinoma[J].Jen-Yang Tang,Edward Hsi,Ya-Chun Huang,Nicholas Chung-Heng Hsu,Yuk-Kwan Chen,Pei-Yi Chu,Chee-Yin Chai.Virchows Archiv.2013(6)
[5]付強.牛病毒性腹瀉病毒持續(xù)性感染的分子機制研究及其定點突變株的構(gòu)建[D].石河子大學(xué),2015.