背景及概述[1][2]
蕨菜，又叫拳頭菜、貓爪、龍頭菜、鹿蕨菜、蕨兒菜、貓爪子、拳頭菜、蕨苔、鍋蓮，是蕨的嫩芽。英文名：Pteridiumaquilinum，屬于鳳尾蕨科。喜生于淺山區(qū)向陽(yáng)地塊，多分布于稀疏針闊混交林。在我國(guó)西北、華北、東北、西南及華中各省區(qū)都有廣泛的分布。其食用記載最早始于《詩(shī)經(jīng)》：“陟坡南山，言采其蕨”，據(jù)《本草綱目》記載：蕨味甘寒,具清熱、滑腸、降氣、驅(qū)風(fēng)、化痰等功效，主治食膈、氣膈、腸風(fēng)熱毒等病癥。
然而，目前研究發(fā)現(xiàn)，蕨菜中存在一種被稱為原蕨苷(原蕨苷quiloside，原蕨苷，CAS：87625-62-5)的化合物，它是蕨菜中的主要致癌物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)如下所示：
原蕨苷
在體內(nèi)和體外的研究都表明，原蕨苷具有細(xì)胞和基因毒性與尿道和胃腸道中的腫瘤發(fā)生直接相關(guān)。同時(shí)流行病學(xué)研究也證明人群在蕨類生長(zhǎng)密集的地區(qū)居住時(shí)間與患胃癌死亡的風(fēng)險(xiǎn)正相關(guān)，而在童年時(shí)暴露于原蕨苷的人群在成年后發(fā)生惡性腫瘤的幾率是未暴露人群的兩倍以上(OR＝2.34)。此外研究還發(fā)現(xiàn)除了直接食用蕨菜外，通過(guò)被原蕨苷污染的牛奶、畜禽肉、甚至地下水均可受到原蕨苷影響。目前，原蕨苷被世界癌癥組織評(píng)級(jí)為2B類致癌物，而原蕨苷在蕨類植物的嫩芽中含量最高。
目前，蕨菜產(chǎn)業(yè)已有一定的規(guī)模，為了食品的安全，有必要對(duì)蕨菜中的原蕨苷含量進(jìn)行監(jiān)控和控制。然而，目前國(guó)內(nèi)尚沒(méi)有高純度原蕨苷標(biāo)準(zhǔn)品的銷售，這對(duì)蕨菜產(chǎn)品的質(zhì)量控制造成了困難。
制備及提純[2]
1、原蕨苷的提取
原料采用新鮮的蕨菜。經(jīng)40℃干燥72h，并粉碎成分經(jīng)200目過(guò)篩后，按照料液比1:10(40g蕨菜，400mL蒸餾水)(1:10至1:100均可，本實(shí)施例具體為1:10)，4℃震蕩提取60min。提取物于4℃，5000rpm離心10min，取上清液進(jìn)一步純化。
2、提取物中干擾物質(zhì)的去除
水提取物中除含原蕨苷外，還存在大量的復(fù)合物(一些多糖、蛋白質(zhì)、厥素B等水溶性物質(zhì))，會(huì)干擾后期原蕨苷的檢測(cè)，故將這些干擾物質(zhì)去除。特別是厥素B，在一定的條件下，原蕨苷會(huì)轉(zhuǎn)化為厥素B。需要進(jìn)一步凈化除去干擾物質(zhì)。具體為：
(1)取200mL粗提液以重力法過(guò)柱(1.0×20cm玻璃小柱，5.00g聚酰胺6樹(shù)脂(購(gòu)自sigma)，干法裝柱)，前100mL洗脫液直接用于進(jìn)一步凈化，后100mL洗脫液需二次過(guò)柱。合并洗脫液(200mL)進(jìn)一步純化。
(2)洗脫液再以XAD2柱純化，即以2滴/s的速度使樣品過(guò)吸附柱(2.5×20cm玻璃小柱，20mLAmberliteXAD2resin(購(gòu)自sigma)，濕法裝柱)，棄去流出液。吸附柱再用蒸餾水洗脫三次，每次15mL，丟棄蒸餾水洗脫液。最后以甲醇洗脫吸附柱三次，每次15mL，合并甲醇洗脫液。置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，低壓，45℃，濃縮至近干。殘留物溶于10mL蒸餾水中移出，再以5mL蒸餾水洗滌兩次，合并溶解液。
(3)合并的溶解液再過(guò)柱凈化(1.0×10cm玻璃小柱，1.00g聚酰胺6樹(shù)脂，干法裝柱)。最初的2mL洗脫液棄去，其余的洗脫液再經(jīng)ChemElut1020硅藻土固相萃取柱(購(gòu)自瓦里安)進(jìn)一步進(jìn)化。用色譜純乙酸乙酯洗脫固相萃取柱，洗脫液收集在圓底燒瓶中，低壓，45℃，濃縮近干。得到0.20g微黃色膠狀物即為原蕨苷粗品?？沙涞?20℃保存待用。
3、原蕨苷的制備HPLC純化
由于原蕨苷粗品純度在20％，可用50％甲醇溶液溶解后以制備型HPLC進(jìn)行分離純化。分離條件：流動(dòng)相為50％甲醇：水，制備型色譜柱(C-18，10uM，25×250mm,購(gòu)自安捷倫)，流速：3mL/min,柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。結(jié)果如圖2所示收集主峰的流出組分。流出組分經(jīng)減壓濃縮后凍干后得到0.04g原蕨苷純品于-20℃保存待用。按原料中原蕨苷含量為4000ug/g(干重)計(jì)算，因此收率為25％。
主要參考資料
[1] 歐玉靜, 王曉梅, 李春雷, & 朱亞龍. (2017). N-甲基吡咯烷酮的應(yīng)用進(jìn)展. 化工新型材料, 45(8), 241-243.
[2] 張軍, & 唐建興. (2011). N-甲基吡咯烷酮合成技術(shù)分析. 合成技術(shù)及應(yīng)用, 26(4), 19-23.
[3] 賈太軒, 姜雄華, & 馮世宏. (2004). N-甲基吡咯烷酮的最新研究進(jìn)展. 遼寧化工, 33(11), 642-644.