背景[1-3]
磷酸鈣細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒在傳統(tǒng)的磷酸鈣細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良，提高了轉(zhuǎn)染效率，并降低了毒性。用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，不僅可以瞬時(shí)表達(dá)，也可以篩選穩(wěn)定株。
HEK293或HEK293T細(xì)胞，即通常所謂的293細(xì)胞，是最適合磷酸鈣法轉(zhuǎn)染的細(xì)胞之一，優(yōu)化條件后轉(zhuǎn)染效率可以高達(dá)90%以上；通常很容易達(dá)到40-50%左右的轉(zhuǎn)染效率。
大多數(shù)常見(jiàn)的細(xì)胞例如Hela細(xì)胞、CHO細(xì)胞等也都適合磷酸鈣法轉(zhuǎn)染，但效率比293細(xì)胞要略低一些。磷酸鈣細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒不僅適合于大多數(shù)貼壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，也適用于一些懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。磷酸鈣細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒提供的試劑都經(jīng)無(wú)菌處理，可以直接使用。
操作步驟
1傳代細(xì)胞準(zhǔn)備細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前24h傳代,待細(xì)胞密度達(dá)50%～60%滿底時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。加入沉淀前3～4h，用9ml完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。
2 DNA沉淀液的準(zhǔn)備首先將質(zhì)粒DNA用乙醇沉淀（10～50μg/10cm平板），空氣中晾干沉淀，將DNA沉淀重懸于μL無(wú)菌水中，加50μL2.5mol/L CaCl2。
3用巴斯德吸管在500μL 2×HeBS中逐滴加入DNA-CaCl2溶液，同時(shí)用另一吸管吹打溶液，直至DNA-CaCl2溶液滴完，整個(gè)過(guò)程需緩慢進(jìn)行，至少需持續(xù)1～2min。
4室溫靜置30min,出現(xiàn)細(xì)小顆粒沉淀。
5將沉淀逐滴均勻加入10cm平板中，輕輕晃動(dòng)。
6在標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)細(xì)胞4～16h。除去培養(yǎng)液，用5ml 1×HeBS洗細(xì)胞2次，加入10ml完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。收集細(xì)胞或分入培養(yǎng)皿中選擇培養(yǎng)。
應(yīng)用[4][5]
用于人iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)及誘導(dǎo)體系的優(yōu)化研究
對(duì)人iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)體系進(jìn)行了一系列優(yōu)化，提供了一個(gè)操作簡(jiǎn)單，無(wú)需復(fù)雜儀器，花費(fèi)不高的方案，具體研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：采用磷酸鈣法和QuickShuttle轉(zhuǎn)染試劑對(duì)慢病毒載體(FU-tet-o-hSox2、FU-tet-o-hOct4、FU-tet-o-hc-Myc、FU-tet-o-hKLF4、FUdeltaGW-rtTA)和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEYK E4進(jìn)行病毒包裝并測(cè)定病毒滴度，同時(shí)研究不同包裝體系、不同轉(zhuǎn)染時(shí)間、有無(wú)明膠包被三個(gè)方面對(duì)使用磷酸鈣法制備病毒和QuickShuttle轉(zhuǎn)染試劑制備病毒的影響。
從以上三方面設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)摸索轉(zhuǎn)染條件。結(jié)果表明，不論是通過(guò)磷酸鈣法制備病毒還是QuickShuttle轉(zhuǎn)染試劑制備病毒，使用pLP1、pLP2和pLP/VSVG的3質(zhì)粒包裝體系，并將轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞鋪在用明膠包被的培養(yǎng)皿上，然后轉(zhuǎn)染72h可獲得較理想的結(jié)果，其中，磷酸鈣轉(zhuǎn)染法獲得的病毒滴度為600TU/mL，QuickShuttle試劑轉(zhuǎn)染法獲得的病毒滴度可達(dá)7130000TU/mL。
使用單細(xì)胞培養(yǎng)法和組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)了hFFCs和MEFs，結(jié)果表明，通過(guò)組織塊培養(yǎng)法獲得的原代細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)更好，且傳代后極少出現(xiàn)懸浮的死細(xì)胞。將MEFs用絲裂霉素C處理后，成功制備了飼養(yǎng)層細(xì)胞。將hFFCs用病毒感染并觀察其形態(tài)變化。
參考文獻(xiàn)
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[5]程騰.人iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)及誘導(dǎo)體系的優(yōu)化[D].內(nèi)蒙古科技大學(xué),2014.