背景[1-3]
BAX(小鼠來源抗體)以人工合成的Bax氨基端(Amino-terminal)的一段多肽為抗原制備而成的抗Bax小鼠單克隆抗體?？寺√枮?A7(Clone6A7)，是應(yīng)用最廣的Bax抗體?？贵w類型為Mouse IgG1。
本Bax抗體可以檢測內(nèi)源性水平的Bax，未發(fā)現(xiàn)和其它Bcl-2家族蛋白有交叉反應(yīng)。Bax是一種促凋亡蛋白，上調(diào)Bax蛋白水平可以促進細胞凋亡。在通過線粒體應(yīng)激誘導的細胞凋亡中Bax起關(guān)鍵作用。
bax基因是人體最主要的凋亡基因，屬于bcl-2基因家族，編碼的Bax蛋白可與Bcl-2形成異二聚體，對Bcl-2產(chǎn)生阻抑作用。研究發(fā)現(xiàn)Bax/Bcl-2兩蛋白之間的比例關(guān)系是決定對細胞凋亡(Apoptosis)抑制作用強弱的關(guān)鍵因素，因此認為，bax是極重要的促細胞凋亡(Apoptosis)基因之一。
Bax可以形成寡聚體，然后從細胞漿中轉(zhuǎn)移到線粒體膜上；通過和線粒體膜上的一些pore proteins相互作用，增強線粒體的通透性(permeability)；最后導致細胞色素c釋放(cytochrome c release)、caspase-9激活以及后續(xù)的其它caspase激活和最終的細胞凋亡。Bax可以和Bcl-2形成多聚體，來調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性，最終調(diào)節(jié)細胞的凋亡或存活。
試驗中適用組織為石蠟切片，其陽性部位為細胞漿，陽性對照為乳腺癌，組織處理為熱修復。BAX是與BCL-2同源的水溶性相關(guān)蛋白，是BCL-2基因家族中細胞凋亡促進基因，BAX的過度表達可拮抗BCL-2的保護效應(yīng)而使細胞趨于死亡。目前多和BCL-2一起用于腫瘤的研究。
應(yīng)用[4][5]
用于胰島素受體底物1通過PI3K/Akt通路下調(diào)大鼠成骨細胞NFκB和BAX表達促進成骨細胞增殖研究
Bcl2（B-cell lymphoma2,Bcl2）家族長久以來被認為是凋亡主要調(diào)節(jié)機制，其中Bcl2抑制凋亡，BAX促進凋亡，二者獨立調(diào)節(jié)凋亡。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠凋亡顯著增加。糖尿病時，高糖環(huán)境引起細胞損傷，BAX激活和引起其他促凋亡蛋白如細胞色素C釋放。1型糖尿病小鼠骨中成骨細胞凋亡增加。一些研究表明IRS1具有抗凋亡能力，IRS1可通過調(diào)節(jié)Bcl2調(diào)控凋亡。研究組前期試驗顯示2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病可能與骨組織IGF1、IRS1、IRS2表達受抑制有關(guān)，同時可能與骨組織PI3K、Akt表達降低、NFκB表達升高有關(guān)。
方法：1提取Wister大鼠肝臟RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。根據(jù)NCBI提供的IRS1基因編碼序列，委托DNA合成公司合成帶適當酶切位點的引物，以cDNA作為模板合成IRS1，插入pEGFP-N1質(zhì)粒，獲得過表達IRS1的表達載體。體外轉(zhuǎn)染人Hela細胞。
2酶消化聯(lián)合組織塊法體外培養(yǎng)Wister大鼠成骨細胞，倒置顯微鏡下觀察成骨細胞形態(tài)，傳代至第二代時茜素紅染色鑒定成骨細胞。傳代至第二代時pEGFP-N1-IRS1表達載體脂質(zhì)體法LipofectamineTM2000瞬時轉(zhuǎn)染成骨細胞，同時應(yīng)用PI3K激酶特異性抑制劑LY294002阻斷PI3K/Akt通路，免疫熒光和Western blotting法觀察成骨細胞NFκB表達變化。
3酶消化聯(lián)合組織塊法體外培養(yǎng)Wister大鼠成骨細胞，傳代至第二代時pEGFP-N1-IRS1脂質(zhì)體法LipofectamineTM2000瞬時轉(zhuǎn)染成骨細胞，同時應(yīng)用LY294002阻斷PI3K/Akt通路，觀察成骨細胞IRS1/PI3K/Akt通路及BAX的表達變化。同時檢測成骨細胞細胞周期。
參考文獻
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[5]馬歡.胰島素受體底物1通過PI3K/Akt通路下調(diào)大鼠成骨細胞NFκB和BAX表達促進成骨細胞增殖[D].河北醫(yī)科大學,2014.