背景[1-3]
人組蛋白H3(H3)ELISA試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知待測物質(zhì)濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內(nèi)進行檢測。先將待測物質(zhì)和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中待測物質(zhì)的濃度呈比例關(guān)系。
人組蛋白H3(H3)ELISA試劑盒操作步驟
1）使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。
2）根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復孔的盡量做復孔。標本用標本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應孔內(nèi)。
3）加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。
4）甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
5）每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6）甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
7）每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。
8）取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結(jié)果。
9）在450nm波長處測定各孔的OD值。
應用[4][5]
用于組蛋白H3Ser10及H3Ser28磷酸化在人卵母細胞成熟及IVF/ICSI來源的早期胚胎發(fā)育過程中的變化研究
組蛋白磷酸化是組蛋白翻譯后修飾(post translational modifications,PTMs)的一種,定義為組蛋白N-端氨基酸殘基的磷酸化修飾。組蛋白翻譯后修飾為一類常見的表觀遺傳修飾類型。組蛋白磷酸化與減數(shù)分裂和有絲分裂中的染色質(zhì)凝縮、調(diào)節(jié)染色質(zhì)功能、DNA損傷的修復、轉(zhuǎn)錄的抑制與激活等多種生物學功能相聯(lián)系。組蛋白磷酸化修飾在哺乳動物卵母細胞的成熟及早期胚胎發(fā)育過程中起著十分重要的作用。
而對于哺乳動物組蛋白磷酸化來說,最具有代表意義的就是組蛋白H3Ser10(第10位絲氨酸)和H3Ser28(第28位絲氨酸)的磷酸化。但是,過去的很多組蛋白磷酸化修飾在卵母細胞減數(shù)分裂和胚胎發(fā)育過程中的功能相關(guān)性研究都集中在動物身上,比如小鼠、兔子以及豬等。而對于組蛋白磷酸化在人卵母細胞成熟及早期胚胎發(fā)育過程中的變化并無相關(guān)研究。因此,研究旨在通過探究組蛋白磷酸化在人卵母細胞成熟及不同來源的早期胚胎發(fā)育過程中的變化方式,完善人類輔助生殖的相關(guān)基礎研究,以期為尋找更好的篩選優(yōu)質(zhì)卵子、胚胎方法打下基礎。
研究組蛋白H3Ser10及H3Ser28磷酸化在人類卵母細胞成熟和IVF/ICSI來源早期胚胎發(fā)育過程中的變化規(guī)律,完善人類輔助生殖技術(shù)相關(guān)基礎研究。
參考文獻
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[2]Histone H3 phosphorylation–A versatile chromatin modification for different occasions[J].Anna Sawicka,Christian Seiser.Biochimie.2012(11)
[3]Structural Basis for the Recognition of Phosphorylated Histone H3 by the Survivin Subunit of the Chromosomal Passenger Complex[J].A.Arockia Jeyaprakash,Claire Basquin,Uma Jayachandran,Elena Conti.Structure.2011(11)
[4]Signals and Combinatorial Functions of Histone Modifications[J].Tamaki Suganuma,Jerry L.Workman.Annual Review of Biochemistry.2011
[5]馬寧趙.組蛋白H3Ser10及H3Ser28磷酸化在人卵母細胞成熟及IVF/ICSI來源的早期胚胎發(fā)育過程中的變化研究[D].鄭州大學,2017.